méthodes de lyse

[invitea4e44b14]

Bonjour à toutes et tous.

Afin d'étudier une activité enzymatique hydrolase, j'ai besoin de lyser mes cellules (MCF7 et NIH 3T3).
Je n'ai utilisé jusqu'à présent que la méthode par sonication, mais j'ai une forte perte d'activité probablement due à une dégradation/dénaturation des protéines.
Je voudrais donc savoir si quelqu'un utilise d'autres méthodes (cycles congélation-décongélation, utilisation de détergeants) et si oui quels en sont les avantages et les inconvénients.

J'ai pensé également à ajouter sur les culots un cocktail d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases avant la lyse, mais je ne sais pas si ces inhibiteurs ne risquent pas d'interférer avec mon activité enzymatique.

merci de vos suggestions.
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[invitea74c0747]

Tu peux congeler à - 80°c, ça fait éclater les cellules...

[invite0345d784]

Tout dépend de ce que tu veux faire précisément ensuite. Parfois une simple lyse mécanique est bien plus efficace que toutes les lyses biochimiques.

[inviteffc67642]

Perso, je fais 3 cycles de congélation dans l'azote/décongélation à 37°C, et après centri, les protéines sont plutôt jolies... (WB par ex.)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea4e44b14]

Merci bien Elendil, je vais faire un comparatif entre ta méthode et celle que j'utilise jusqu'à présent pour une activité enzymatique de réf et je trancherai.
Je mettrai les résultats sur cette discussion au cas où ça intéresserai quelqu'un.

[invite2a651650]

bonjour,

depuis toujours je lyse mes cellules (lignées intestinales pour info) avec une solution TNE (Tris naCl EDTA) + 1% Triton X-100.
a un moment je regardait l'activité de la dipeptidyl peptidase IV et de la phosphatase alcaline.
ai jamais eu de problème.

par contre, pour bosser sur l'activité enzymatique, on m'a toujours déconseillé de soniquer.