Dialyser un Antigène

[invite4ae3ed6a]

Bonjour tout le monde,
J'ai trouvé dans un protocole donné cette phrase que je n'ai pas comprise:
"Dialyze the Antigen against 20 mM sodium borate at 4°C"

Qu'est ce que celà peut bien signifier svp


Bien cordialement,
Cysto
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[vpharmaco]

Avec un peu plus de contexte, ce serait peut-être un peu plus simple à interpréter.
L'antigène en question est une protéine ? Il peut s'agir d'une étape d'échange de tampon (pour mettre l'antigène dans le tampon borate indiqué; la dialyse est une méthode douce, mais longue). On utilise aussi parfois la dialyse pour éliminer des composés de faible poids moléculaire.

[invite4ae3ed6a]

Oui l'Ag est une protéine.
Contexte: Lateral Flow Immunoassay

Comment faire cette dialyse du point de vue "pratique" ? Préparer 0,2mmol de borate sodium dans 1L d'eau distillée, ensuite mélanger une certaine quantité avec l'Ag ?? c'est ça ?

[vpharmaco]

Traditionnellement, une dialyse s'effectue avec un boudin de dialyse (un tube dont la membrane semi-perméable possède une porosité définie https://www.dutscher.com/frontoffice...uitId=0L-12-01). La solution à dialyser est enfermée dans le tube, et on place l'ensemble dans un volume important de solution (ici le tampon), que l'on renouvelle régulièrement. L'équilibration se fait par osmose.

[A voir en vidéo sur Futura]

[vpharmaco]

Suivant les besoins et la résistance de la protéine, l'ultrafiltration permet de faire la même chose de façon plus rapide et plus simple https://www.dutscher.com/frontoffice...renceId=044024

[invite4ae3ed6a]

Si jamais on ne dispose pas de boudin de dialyse (membrane de dialyse), existe t il une alternative à celà ??


Après dialyse, l'Ag se retourve donc dans le tampon c'est ça ? donc pour la prochaine étape du protocole, on nous demande d'utiliser 2ml de la solution d'antigène, on utilise donc 2ml du tampon dans lequel on a trempé l'antigène ... c'est ça ?

[vpharmaco]

Il y a l'alternative indiquée au dessus. Suivant les besoins, on peut aussi envisager les méthodes chromatographiques (gel filtration, chromatographie d'affinité).

Avant dialyse, on a X ug de protéine dans Y uL d'un tampon A. A la fin de la dialyse, on récupère X ug de protéine dans Y uL du tampon de dialyse.
(enfin bon, ça c'est si tout va bien, que la protéine n'accroche pas à la membrane, et que l'on arrive à récupérer toute la solution dans le boudin...)

[invite4ae3ed6a]

Excusez moi mais je suis perdue :
1- Pourquoi dialyser l'Ag ? pourquoi ne pas le faire dissoudre directement dans le tampon ?
2- pour moi les méthodes chromatographiques c'est pour séparer, pourquoi séparer alors que je veux mélanger l'antigène au tampon borate ?? je comprends pas !!

[vpharmaco]

Excusez moi mais je suis perdue :
1- Pourquoi dialyser l'Ag ? pourquoi ne pas le faire dissoudre directement dans le tampon ?

Tu sauras mieux répondre à cette question que moi. C'est toi qui souhaite "dialyser un antigène"

- Si la protéine est en solution dans un tampon donné (ce qui est le cas si l'on envisage de faire une dialyse), la simple dilution dans le nouveau tampon conduit à une très/trop forte dilution de la protéine d'intérêt, qu'il faut alors reconcentrer (en général par ultrafiltration, qui fait aussi intervenir des membrane semi-perméables...).
- La dialyse permet également d'éliminer des petites molécules présentent dans le tampon initial et qui pourraient interférer dans l'expérience que l'on souhaite mener. Par exemple, on conserve parfois les protéines avec un faible pourcentage d'azoture de sodium, NaN3. Celui-ci peut poser soucis pour certaines manip et il faut donc l'éliminer avant utilisation. La dialyse permet de l'éliminer presque totalement. La simple dilution va juste le diluer autant que la protéine...

2- pour moi les méthodes chromatographiques c'est pour séparer, pourquoi séparer alors que je veux mélanger l'antigène au tampon borate ?? je comprends pas !!

Euh, c'est toi qui demande des alternatives à la dialyse car tu veux faire une dialyse sans membrane de dialyse. Je propose des choses...
La gel-filtration est moins efficace qu'une dialyse bien effectuée, mais elle permet également d'échanger le tampon d'une protéine sans trop la diluer (on parle de desalting. L'idée est que les protéines migrent plus vite dans la colonne que les sels contenus dans le tampon initial).

[invite4ae3ed6a]

Très bien super merci beaucoup pour vos réponses