Bonjour,
Dans le cadre de mes études en L3 science de la vie, je dois préparer un TP.
La consigne est :
Etablissement du protocole d’ensemencement des thymocytes : Rédigez le protocole permettant de réaliser la mise en culture décrite ci-dessous à partir de l’observation suivante :
Après une dilution au 1/20ème d’un aliquot de la suspension initiale (5ml) de thymocytes, voici ce que vous observez au microscope (image jointe).
La mise en culture décrite est celle-ci :
Vous disposez de 5 ml de suspension de thymocytes dans du PBS.
Prélevez 10 μl et, après dilution au 1/10ème , comptez sur cellule de Malassez .
Après avoir déterminé la concentration de votre suspension initiale de 5 ml de cellules, diluez vos cellules à 3.10^6 cellules par ml dans du milieu de culture RPMI complémenté par 10% de sérum de veau fœtal ainsi que par des antibiotiques et antimycotiques (milieu déjà prêt sous hotte).
Ensemencez ensuite les 6 puits d’une plaque de culture “6 puits” avec deux ml de cette suspension cellulaire à 3.10^6 cellules par ml (chaque puits contiendra 2 ml de suspension cellulaire).
Ajoutez la drogue 1 (D1- concentration mère/stock 10-3M) à 10-6 M final et les drogues 2 (stock à 20mM) et 3 (stock à 5mM) (D2 à 20 μM final; D3 à 50 μM final), dans les puits. Incuber dans une étuve à CO2 sur la nuit
Je ne suis pas du tout sûre de moi, mais concernant le protocole à décrire, je pense qu’il faut toujours prélever 10 μl mais cette fois le diluer au 1/20ème.
J’ai compté sur cellules de Malassez (image jointe) et trouvé 11.10^6 cellules par mL. Ainsi une concentration de 55.10^6 de cellules pour la suspension initiale.
Il faut après « diluez les cellules à 3.106 cellules par ml », et je ne vois pas du tout comment faire pour déterminer le coefficient de dilution de la solution.
Et ensuite je continue le protocole comme décrit plus haut.
Pourriez-vous m’indiquer si je pars sur la bonne piste, ou pas du tout ? Et si c’est le cas, m’expliquer comment déterminer le coefficient de dilution pour obtenir 3.106 cellules par ml.
Merci d’avance!
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Envoyé par Mar18 