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influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines



  1. #1
    nnt21

    influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Bonjour,

    Je suis actuellement en stage et je travaille sur les peptides signaux de sécrétion.
    L'une des protéines sur laquelle je travaille est produite intracellulairement (et donc elle n'est pas sécrétée).
    J'ai supposé que c'était peut être parce que le peptide signal n'est pas clivé après la translocation de la protéine, ce qui gène la sécrétion.

    Etant donné que je suis livrée à moi-même (mon maitre de stage n'est pas très présent ), si vous avez d'autres suggestions pour expliquer ce phénomène, elles seront les bienvenues.

    Merci d'avance pour votre aide,
    nénette21

    -----


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  3. #2
    Yoyo

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Salut

    Si le peptide signal n'est pas clivé il y a de forte chance pour que ta protéine se retrouve plutot coincé dans la membrane. Si elle est uniquement cytoplasmique je pencherait pour un autre type de probleme. es tu certain qu'il y a bien un peptide signal? comment sais tu qu'elle devrait etre sécrétée? et puis tu devrais nous dire aussi dans quel organisme tu bosses ca serait plus facile.

    Yoyo

  4. #3
    nnt21

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Je travaille avec des cellules de mammifères.
    Je suis certaine qu'il y a bien un peptide signal, j'ai fait les constructions en biologie moléculaire et je les ai vérifiées par séquencage.
    J'ai utilisé 12 peptides signaux différents, seulement deux ont permis la sécrétion en très faible quantité de ma protéine (0,6 mg/L).
    D'après tes explications, je comprend que ma protéine doit être reconnue comme une protéine transmembranaire?

  5. #4
    Akïn

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Citation Envoyé par nnt21 Voir le message
    Bonjour,


    L'une des protéines sur laquelle je travaille est produite intracellulairement (et donc elle n'est pas sécrétée).

    nénette21
    juste une petite remarque, le fait qu'elle soit produite intracellulairement ne veut pas forcément dire qu'elle n'est pas excrété. Regarde une proteine comme l'insuline est produite intracell mais est pourtant sécrétée par la suite.

    Peux tu nous donner le nom de la protéine en question si tu l'as, c'est ptet plus facil si on sait de laquelle il s'agit.

    Si tu peux également nous donner le modèle cellulaire sur lequel tu travaille, ca serrait le top =)

  6. #5
    Akïn

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Citation Envoyé par nnt21 Voir le message
    Je travaille avec des cellules de mammifères.
    Je suis certaine qu'il y a bien un peptide signal, j'ai fait les constructions en biologie moléculaire et je les ai vérifiées par séquencage.
    J'ai utilisé 12 peptides signaux différents, seulement deux ont permis la sécrétion en très faible quantité de ma protéine (0,6 mg/L).
    D'après tes explications, je comprend que ma protéine doit être reconnue comme une protéine transmembranaire?
    es tu sure que ta protéine est sécrété intracellulairement ? Si tu as un anticorps spécifique, essai de faire une immunofluorescence (si tu as du matos à épifluorescence ou mieux encore: un microscope confocal), ca te permettra de voir un peu où sont localisées tes proteines intracellulairement: niveau membranaire ou en vésicules encore.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    nnt21

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Une partie de mon travail est confidentiel donc je ne peux pas vous donner le nom de la protéine.
    Mais je peux donner quelques informations : il s'agit d'un domaine extracellulaire d'un récepteur membranaire. Il y a modification post-traductionnelle (glycosylation surtout). Il y a pas de clivage ou autre de la protéine qui pourrait s'apparenter à un mécanisme comme celui pour l'insuline.

    Cette protéine est produite dans les cellules de mammifères

    Je ne pense pas que le fait d'avoir isolé un domaine extracellulaire de ce récepteur soit vraiment la cause de l'absence de sécrétion, sinon je n'aurais pas eu des protéines sécrétées avec deux peptides signaux.

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  10. #7
    Yoyo

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Salut

    Les domaines transmembranaires sont de tres forts inhibiteurs de la secretion, car la protein va se loger dans la membrane et ne peut plu setre sécrétée, je pense que ton probleme pourrait se trouver a ce niveau la. En tout cas a chaque fois que j'ai vu un protocole pour purifier des proteines sécrétées il etait précisé qu'il ne fallait pas de domaines transmembranaires. Donc es tu certaine de n'avoir que la partie extracellulaire? et qu'il n'y a pas un domaine hydrophobe qui traine quelquepart?

    EDIT: sinon ca n'a rien a voir avec un probleme de sécrétion, mais peut etre que ta proteine tronquée n'est pas stable, et est donc dégradée immédiatement (ca expliquerait les faibles quantité de secretion que tu as pu observer avec deux peptide signaux)

    YOyo
    Dernière modification par Yoyo ; 23/08/2006 à 11h52.

  11. #8
    nnt21

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Citation Envoyé par Akïn Voir le message
    es tu sure que ta protéine est sécrété intracellulairement ?
    Oui, j'ai fait une analyse par Western Blot (2 anticorps, révélation électroluminescente). Je ne retrouve rien dans le surnageant, mais je retrouve la protéine dans la fraction soluble et non soluble après la lyse des cellules.

  12. #9
    Akïn

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Citation Envoyé par nnt21 Voir le message
    Oui, j'ai fait une analyse par Western Blot (2 anticorps, révélation électroluminescente). Je ne retrouve rien dans le surnageant, mais je retrouve la protéine dans la fraction soluble et non soluble après la lyse des cellules.
    ce que je sous entendait, c'est que toutes les cellules sont sécrété vers le milieu extracellulaire le sont via des vésicules. On ne sort pas d'une cellule par simple passage de la membrane plasmique. Il faut necessairement une vésicule.

    Peut etre ne peux tu pas mais pour savoir ou se trouve ta localisation, voici une piste a suivre eventuellement.
    Beaucoup de protéines excrété le sont via une voix clathrine dépendance.
    dis moi ce que tu penses de ca:
    1°) tu perméabilise la membrane de tes cellules avec du triton ou de la saponine
    2°) tu incubes avec du milieu 10% SVF histoire de saturer les sites non spécifiques.
    3°) incubation avec des anticorps dirigés contre la clathrine et contre ta protéine en question. par exemple un rabbit anti-clathrine et un mouse anti-protéineX
    4°) tu utilises des anticorps secondaire genre un 488 anti-Rabbit (ta clathrine apparaitra donc en vert) et un 546 anti-mouse (la protéine sera alors marqué en rouge)
    5°) observation à l'épifluorescence ou au confocal

    Ca te permettra de voir sa localisation.

    Ca ne reste bien sur qu'une idée. Ne connaissant pas la thématique exacte, peux etre cette etape ne t'est t elle pas indispensable =)

  13. #10
    nnt21

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    effectivement, je ne pourrais jamais faire ca... Dans le labo, personne ne veut entendre parler d'autres choses que des protéines sécrétées.

    Mais merci beaucoup pour toutes vos suggétions, ca m'aide beaucoup dans ma réflexion et ca me permet de renforcer mes hypotheses.

  14. #11
    Svenn

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Vu ce que tu dis, on a l'impression que tes peptides-signaux ne sont pas reconnus par le translocon et qu'ils ne sont donc pas secrétés. Encore que 0,6 mg/l pour une glycoprotéine, c'est quand même pas mal et même très bien pour peu que ta protéine soit assez grosse.

    Tu travailles dans quel hote ?

    Edit : ce n'est pas un problème de clivage post-translocation. Si c'était le cas, ta protéine apparaitrait dans la fraction insoluble membranaire uniquement, ce qui n'est pas le cas parce qu'une partie importante apparait soluble.
    Dernière modification par Svenn ; 23/08/2006 à 15h07.

  15. #12
    nnt21

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    Citation Envoyé par Svenn Voir le message
    Vu ce que tu dis, on a l'impression que tes peptides-signaux ne sont pas reconnus par le translocon
    C'est ce que je pensais alors pour valider mon hypothèse j'ai remplacé le peptide signal naturel d'une protéine sécrétée à un titre de 10 mg/L avec mes peptides signaux. Et dans ce cas ma protéine est toujours sécrétée et au moins à 2 mg/L...

    Je travaille dans les cellules de mammifère

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  17. #13
    Svenn

    Re : influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

    2 mg/ml, ça me semble déjà pas mal en cellules de mammifères. Peut-etre que tu as une proteine naturellement difficile à replier (protéine de plus de 40 à 50 kDa, beaucoup de ponts disulfures, peu de structures secondaires, ... ) et que quelque soit le peptide signal que tu rajoutes, tu arriveras à une expression assez faible de toute façon.

    Mais à 2 mg/ml, tu peux déjà quasiment tout faire ce que tu veux, même si c'est assez fastidieux en cellules de mammifères (2 mg/ml en cellules de mammifères, j'ai déjà donné et c'est vrai que c'est rapidement lourd). A la rigueur, ça peut valoir le coup de tenter en baculovirus, la production sera meilleure, mais il y a un risque d'aggrégation dans le cas d'une glycoprotéine.

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