Faire un KO bi-allélique chez des Calu-3

[Loulou1]

Bonjour et merci d'avoir cliqué sur ce topic.

Voilà, j'ai un petit soucis que je ne sais pas trop comment gérer. Actuellement je suis étudiant et je fais un stage en laboratoire de recherche mais je débute complètement dans le milieu. J'ai des cellules Calu-3 (lignée de cellules d'adénocarcinome pulmonaire) et j'ai besoin de faire un KO d'un gène (MUC5AC) sur ces cellules. Ce KO doit donc être bi-allélique. Mais je ne sais pas du tout comment m'y prendre.

J'ai imaginé un plasmide comme celui-ci :



Légende :
- En orange : Gène de résistance à la néomycine (néoR) qui doit remplacer le gène à invalider (MUC5AC).
- En vert clair : Promoteur fort pour le gène néoR.
- En bleu : Séquences de recombinaison homologue.
- En rouge : Gène de la thymidine kinase pour sélectionner uniquement les cellules qui ont intégré le transgène par recombinaison homologue et PAS au hasard.
- En vert foncé : Promoteur fort pour le gène de la thymidine kinase.

Les cellules seraient transfectées avec ce plasmide par électroporation (ou autre solution si vous avez des conseils).

Voici donc mes interrogations :
1) Est-ce que cette construction pourrait fonctionner ou pas du tout ?
2) Comment sélectionner uniquement les cellules qui ont intégré ce plasmide sur les deux chromosomes et pas uniquement sur un seul des deux (KO bi-allélique) ?
3) Est-ce que les deux promoteurs utilisés peuvent être les mêmes ?
4) Comment choisir les séquences de recombinaisons homologues ? En gros, si j'ai la séquence du gène devant moi, comment je choisis les deux séquences de recombinaison homologue ?
5) Les zones blanches du plasmide, de quelles séquences doivent elles être composées ?

Je sais que mes questions peuvent sûrement paraître nunuches pour les plus pros d'entre vous mais je débute actuellement donc veuillez m'excuser.

Mon maître de stage m'a brièvement parler d'une approche lentivecteur, mais ça me semblerait beaucoup plus long à mettre en œuvre qu'un simple plasmide unique (ou deux) non ?

Je vous remercie pour l'aide que vous pourriez m'apporter.

Bonne soirée !
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[Flyingbike]

avez vous vraiment besoin d'un KO total ? quel est le but ?

La recombinaison homologue c'est loin d'être évident, surtout qu'après il vous faut caractériser l'insertion pour éviter les effets du KI lui même. Et je doute qu'une RH se produise spontanément comme ça dans une lignée.


Pourquoi ne pas en effet partir sur un vecteur lentiviral portant un shRNA contre votre cible ? Commercialement c'est facile à obtenir,.

Dans tous les cas il faudra amplifier et sélectionner les clones et c'est loin d'être évident et rapide.


Je ne comprends pas l'histoire de la thymidine kinase...?

[Loulou1]

Bonjour,

En effet c'est bien un KO total que je voulais faire à la base pour invalider totalement le gène. Si j'utilise seulement un shRNA, l'expression du gène va être simplement réduite et pas abolie, je me trompe ?

La thymidine kinase servirait à sélectionner les cellules qui ont intégré le plasmide via recombinaison homologue au bon endroit uniquement, c'est à dire à la place du gène cible.

J'explique : Après transfection, on met du gancyclovir dans le milieu de culture. Si une cellule exprime le gène de la thymidine kinase, elle va mourir en présence de gancyclovir et donc ne sera pas sélectionnée. Si elle n'a pas ce gène, elle survivra. De là, trois options :
1) Si le plasmide s'intègre aléatoirement dans le génome (et pas au niveau du gène cible grâce à la RH), alors le gène de la TK va également s'intégrer et la cellule ne sera pas sélectionnée.
2) Si au contraire, le plasmide s'intègre par RH, alors le transgène sera intégré à la position voulue par RH, donc le gène de la thymidine kinase ne sera pas exprimé, donc la cellule survivra.
3) Si rien ne s'intègre, alors la cellule n'exprimera pas non plus le gène néoR et sera donc tuée par le G418.

Disons que c'était simplement le plan de base.

[Loulou1]

Topic toujours d'actualité, quelqu'un aurait-il une proposition ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[vgondr98]

As-tu envisagé d'utilise CRISPR-Cas9 ?