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HPLC Mode gradient



  1. #1
    JoJoCerise

    HPLC Mode gradient

    Bonjour c'est encore moi
    Pour valider mon DUT je dois realiser un stage en entreprise Mon sujet consiste à remplacer l'utilisation de l'acetonitrile par du méthanol
    J'utilise le mode gradient ( en opposition au mode isocratique)
    et je voudrais savoir stp à quoi sert-il et pourquoi preferer ce mode au mode isocratique . Quels sont ces avantages et ces inconvenients?
    Merci beaucoup car je suis un peu bloquée pour être autonome dans mon sujet si je ne connais pas toutes les bases
    bonne soirée

    -----


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  3. #2
    JPL

    Re : HPLC Mode gradient

    Le mode gradient permet de sortir des pics qui ne sortirait pas en mode isocratique, ou qui sortiraient trop tard et du coup trop étalés. En quelque sorte cela permet de "tasser" la fin de la courbe. Toute l'astuce consiste à bien choisir la forme du gradient pour sortir proprement tous les pics intéressants.
    Fais attention au méthanol, bien plus toxique que l'acétonitrile (ne pas respirer les vapeurs, éviter tout contact avec la peau car il passe dans le sang à travers la peau). Faire le maximum de manipulations sous hotte. C'est un solvant que j'ai évité chaque fois que cela a été possible.
    Rien ne sert de penser, il faut réfléchir avant - Pierre Dac

  4. #3
    JoJoCerise

    Re : HPLC Mode gradient

    Merci pour les conseils, oui pour les risques c'est pour ça qu'ils utilisaient l'ACN avant, enfin c'était l'une des raisons mais bon avec la rupture mondiale la c'est chaud. t'inquièetes pas je fais attention je mets des gants et quand je le manipule je suis sous hotte.
    j'ai a peu près compris, c'est pour cela qu'on modifie également le debit, pour que les pics sortent assez tot sans pour autant qu'ils soient étalés on est daccord?
    Mais alors pourquoi dns mon tableau de gradients on me fait augmenter le débit vers les minutes ou mon pic va sortir alors que logiquement on devrait l'augmenter avant qu'il sorte pour ne pas perdre de temps et le diminuer quand la molécule sort?

  5. #4
    JPL

    Re : HPLC Mode gradient

    C'est un gradient de débit ou un gradient à débit constant où on augmente progressivement la concentration de méthanol ? Peut-être un gradient eau-méthanol à méthanol croissant ?
    Petit complément théorique : le mode isocratique est très adapté aux cas où on a dans un échantillon quelques substances aux propriétés très proches. Au contraire les gradients sont adaptés à la séparation de mélanges de produits très divers.
    Rien ne sert de penser, il faut réfléchir avant - Pierre Dac

  6. #5
    JoJoCerise

    Re : HPLC Mode gradient

    desolée jai du mal mexpliquer
    en fait je dois doser le thiopental
    et je fonctionne avec un changement de pourcentage de solvant organique dans ma phase mobile ( cest à dire acetonitrile/tampon/methanol) mais a partir de 16minutes ( la ou le thiopental sort) on augmente le debit pour le rediminuer quand mon thiopental est sorti

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    JPL

    Re : HPLC Mode gradient

    C'est certainement pour avoir un pic assez étroit et bien défini et peut-être aussi pour avoir en sortie une fraction recueillie dans un seul tube du collecteur de fraction. Mais de loin on ne peut faire que des suppositions.
    Rien ne sert de penser, il faut réfléchir avant - Pierre Dac

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  10. #7
    JoJoCerise

    Re : HPLC Mode gradient

    ah oui daccord je comprends mieux merci beaucoup JPL
    je vais mieux voir tout ça demain.
    Merci encore

  11. #8
    JoJoCerise

    Re : HPLC Mode gradient

    Voila ça y est, j'ai bien tout compris en ce qui concerne le mode gradient!
    Maintenant dans mon rapport je dois expliquer la méthode de l'étalon interne, la je pense que je vais men sortir.
    Par contre, au point de vue pratique, lorsque je pass mon témoin avec mon etalon interne, est ce que sur mon chromatogramme je dois avoir des pics TRES séparés ou pas?
    parce que mes pics sont collés mais on distingue bien les deux pics est-ce suffisant?
    Merci encore

  12. #9
    jgiovan

    Re : HPLC Mode gradient

    Citation Envoyé par JoJoCerise Voir le message
    Voila ça y est, j'ai bien tout compris en ce qui concerne le mode gradient!
    Maintenant dans mon rapport je dois expliquer la méthode de l'étalon interne, la je pense que je vais men sortir.
    Par contre, au point de vue pratique, lorsque je pass mon témoin avec mon etalon interne, est ce que sur mon chromatogramme je dois avoir des pics TRES séparés ou pas?
    parce que mes pics sont collés mais on distingue bien les deux pics est-ce suffisant?
    Merci encore
    Si ta séparation est robuste et reproductible, pas de problème.
    Ce n'est pas une mauvaise chose d'avoir un étalon interne assez proche de la substance mesurée. C'est très conseillé pour la GC (risque de ségrégation) mais ca peut avoir son intérêt en LC.

  13. #10
    JoJoCerise

    Re : HPLC Mode gradient

    Apparament mon patron n'est p as ok pour qu'on garde ces pics la,
    je travaille en HPLC à barrette de diode en mode gradient mais bon le truc cest que jai poussé au max mon tableau de gradient, je vois plus quoi modifier dedans. As que je diminue le temps ou la composition daceytonitrile diminue? je sais pas du tout

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