HPLC dosage des amines biogènes

[invitea0ce3481]

*Je suis un petit nouveau alors si je ne fais pas ma demande selon la bonne procédure, toutes remarques sera constructives.

Bonjour,

Voila je suis en stage dans un laboratoire pendant 3 mois, et j'ai une mission à effectuer. Vous comprendrez de ce fait, que par souci de confidentialité, certains paramètres ne pourront être divulgués.

Comme le dit l'intitulé, j'ai un projet à réalisé qui est la mise en place et la validation d'une methode de dosage des amines biogènes dans un aliment par une méthode non-isocratique.

Infos colonne:
Marque: XBridge de Waters
Chaine carbonnée: C18 à 3.5Micrometre
Mensurations: 4,6*150
*J'utilise également une précolonne appropriée
Eluant A: Solution tampon à pH=7
Eluant B: Solution de methanol pur

Problème:
Type: Coélution de 2 composés.
Molécules concernées:
*1-Butylamine C₄H₁₁N
M=73,14
pKa=10,59

*Putrescine C₄H₁₂N₂
M=88,1
pKa=10,8

Mon problème serait de jouer sur mon gradient de solvant aux alentours du temps de rétention de la coélution. Cependant, mes essais ne sont pour le moment pas concluant bien que j'observe une amélioration en faisant un pallié à ces alentours.

D'après vous comment je pourrais m'y prendre, j'ai dejà effectuer 15 methode sans résultats...
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[invite9ad979a3]

Salut

D'abord simple question....le détecteur est ce un UV ??? ou par chance un délicieux spectre de masse....

[invitea0ce3481]

Alors je ne suis ni en simple UV ni en spectre de masse (ce serait un peu trop simple et les éluants utilisés ne pourraient me le permettre).

J'utilise un détecteur fluorimétrique. En effet auparavant j'effectue une dérivation de mes AB par de l'AQC (6-aminoquinolyl-N-succinimidyl carbamate) qui confère à mes amines biogènes une fluorescence grace à ses 2 noyaux benzeniques.

A ton avis je dois jouer sur le pH de ma solution tampon?
Je viens à l'instant de passer mon échantillon à différents gradient de solvant sur ce pallié en obtenant toujours la même coélution. La seule amélioration obtenue est apparue lorsque j'ai elué à 50%/50% par mes 2 éluants cités plus haut.

*Si je ne suis pas assez claire, n'hésites, je ne suis qu'en 1ere année de BTS ANA et je ne maitrise encore pas toute les notions

*En tout cas merci pour ta réponse si rapide

[invite9ad979a3]

De rien

As tu déja testé sur une autre colonne avec un tampon acide ??

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0ce3481]

Nan je n'ai pas essayé, et je ne pourrais le faire, je n'ai qu'une seule colonne, et je dois me débrouillé avec. J'ai simplement l'assurance que c'est possible..
Sinan la colonne suporte des ph allant de 2 à 10. J'ai également aussi un système de chauffage.

Je résume je peux agir sur Différents paramètres:
-Débit (Actuellement 0.95ml/min)
-Proportion de solvant / Temps
-Température (actuellement 37°)
-pH du tampon (Actuellement 7)
*Et la longueur d'onde d'excitation ainsi que la longueur d'onde d'émission qui sont à priori optimum et qui n'affecte en rien la séparation...

Je sais également que le méthanol est un solvant fort polaire (il me semble) peut-être que la différence de flux agirait sur la séparation?!

[invite9ad979a3]

Pq tu ne peux pas essayer à pH 2 ou 3 ??

[invitea0ce3481]

De rien

As tu déja testé sur une autre colonne avec un tampon acide ??

Je disais non pour ce parametre, car je n'ai qu'une seule colonne. =)

Sinan oui j'y pense mais qu'est-ce que ca changerait? Les pkA sont quasi identiques, ce qui signifie une même forme ionique, et donc une parfaite osmose si je puis dire ^^

Saurais-tu des choses que j'ignore?!

[invite9ad979a3]

par ce qu'ensuite, cela à un impact sur la colonne en elle même.

Si ton gradient ou ta temperature ne changent rien, le débit na pas vraiment influence directe sur la separation. Tes limité à une colonne. Donc je pense que seul le pH pourra avoir une influence...

[invite9ad979a3]

Sinon as tu essayé juste avec methanol et eau ??

[invitea0ce3481]

Je suis ton raisonnement, qui est plutot pertinent dans mon cas.
Pour changer le pH je dois refaire une solution tampon qui me sera permis dés la semaine prochaine, je t'en dirais plus donc dés mardi prochain (le temps que je lance la manip').
Sinan non je n'ai pas essayé seulement methanol/eau, cependant dés que je dépasse les 70% de methanol, tout le monde est coélué (jobserve à la fois 9 AB) baila la BOMBA, c'est la fete.

Le pH me semble etre en effet la seule piste!

J'ai relancé 3 analyses en débit différents et 3 analyses avec un pallier de proportionnalité plus grand (avant j'étais a 5min 50%/50% => je passe à 10min 50%/50% ). Parce qu'une stabilastion du flux peut également influencer la séparation (corrige moi si je me trompe ^^)

Je mettrais a jour mes observations dés demain. Merci pour tout**

[HarleyApril]

Bonsoir

Dans le cas de la butylamine, la basicité est masquée par la dérivatisation.
Ce n'est pas le cas pour la putréscine.
Changer de pH a donc de l'intérêt.

Cordialement

[invitea0ce3481]

Merci pour vos réponses!
J'ai alors laissé toute la nuit l'analyse se dérouler et lorsque je modifie le pallier de temps a 50/50... ILS SE SEPARENT =D J'ai trouver la solution du gradient. Maintenant pour une optimisation de la methode je vais voir avec le pH.
Harley, je ne suis pas ferru de chimie mais j'ai ma certaine par d'intérêt malgré mes difficultés de compréhension... Pourrais-tu m'expliquer en quoi la dérivation modifie la basicité de l'une et non de l'autre, car leur structure chimique et stéréochimique reste relativement la même

[invite9ad979a3]

Cest cool si tu arrive à les séparer.
A l'occasion met nous un chromato qu'on puissent juger de ta séparation

Lu

Alex

[invitea0ce3481]

Pour le moment la séparation n'est pas parfaite, je vais encore jouer avec le gradient de solvant, je vais déterminer les limites et apres jouer sur le pH.

Je vous fais parvenir ca dés que possible. Merci de vos aides et si jamais tu sais en quoi la dérivation joue sur la basicité ... je suis preneur de l'explication

[invitea0ce3481]

Voici mes 2 chromato. La première est le meilleur résultat que j'ai eu jusqu'à obtention de la 2eme chromato (avec le zoom sur l'endroit litigieux respectif):

Chromato1:

Zoom1:


Chromato2:

Zoom2:

[invite9ad979a3]

Meme si on ne voit pas super bien , cela semble correct.

Good job

Alex

[invitea0ce3481]

C'est loin d'être sufisant! En elargissant la periode, la coélution se raproche...

Je me tourne donc vers ta théorie.

... la suite apres quelques pages de pub