Bonjour,
J'ai un TP à analyser sur l'activité enzymatique, et on me demande de calculer Km et Vmax à l'aide de l'équation de la courbe en représentation des doubles inverses(178.6x+1,213). J'ai trouvé 1/Vmax qui me permet d'avoir Vmax (0,8244) mais mon Km est élevé (147)....
Pouvez vous m'aider s'il vous plaît ?
Merci d'avance
Bonjour,
Je ne vois pas d'erreur de calcul.
Problèmes d'unité dans les données ?
Je ne sais pas mais un ami a trouvé 58 pour le Km et 0.48 pour le Vmax a votre avis c un problème d'unités
Si vous trouvez qu'il y a un problème d'ordre de grandeur 58 ou 147 cela se vaut.
Difficile d'aller plus loin sans les données.
D’après la vitesse d’hydrolyse du substrat en ΔDO / min, calculer la vitesse d’hydrolyse
du substrat en mmol/min/L, sachant que �� (L.mol-1
.cm-1
) = 8800 à 410nm.
A partir des données collectées, reportez les vitesses initiales obtenues (DO) en
fonction du temps pour chaque concentration initiale en substrat testée (8 mM, 4 mM,
2 mM, 1 mM, 0.5 mM).
Après avoir tracé le diagramme de Lineweaver et Burk, déterminez le Km et le
Vm de l’enzyme.
OK, donc si à partir des données et tracé de y=1/V=f(x=1/S) vous trouvez y=178.6x+1,213, je confirme que Vmax=0,824 xxx et Km=147 yyy.
On ne peut rien faire de plus à partir des données fournies.
J ai obtenu les vitesses initiales qui sont :
Pour 8 mm: 0.053386 mmol.min.L
Pour 4 mm: 0.0238 mmol.min.L
Pour 2 mm: 2 0.0105 mmol.min.L
Pour 1mm : 0.0052 mmol.min.L
Pour 0.5 mm : 0.0028 mmol.min.L
Je trouve approximativement la même chose : 181*x+0,973.
Le problème est que vous utilisez des données au tout début de la courbe V=f(S) (les croix) alors que Vmax et Km (droites bleues approximatives) sont assez loin.
La précision sur Vmax et Km est donc probablement sujette à caution.
Un essai avec Cornish-Bowden donne des résultats aberrants.
Merci pour la réponse
Mais est ce que le Km ne vous semble pas un peu grand ?
Pour la valeur de Km, c'est un problème d'ordre de grandeur de catalyse enzymatique, je vous laisse juge.
Par contre, voila la courbe en double inverse obtenue (si j'ai correctement recopié vos données)
Cinet1.png
Et une allure usuelle
Cinet2.png
Sachant que 1/Vmax est l'intersection avec l'axe des ordonnées, on voit que votre Vmax est très approximatif et comme Km=Vmax*pente le Km aussi.
Le problème est donc dans l'obtention des vitesses initiales (ou les données y conduisant)
J'obtiens exactement la même courbe en double inverse mais j'ai verifiéa méthode pour avoir les Vi et voici les instructions du professeur:
A partir des pentes de courbes de chaque concentration en substrat testée, calculer la
Vitesse d’hydrolyse [Vi] en mmol/min/L grâce à la formule de l’absorbance de Beer-
Lambert : 𝛥𝐷𝑂 = 𝜀 ∗ 𝑙 ∗ 𝑐. On connait 𝛥𝐷𝑂 (pente des courbes), on connait 𝜀 (𝜀 (L.mol-1.cm-1) = 8800 à 410nm.) et on connait 𝑙 (1 cm). On cherche donc 𝑐. Attention aux unités. On
exprime en mmol/min/L.
Du coup j'ai pris les coefficients directeurs de chacune des droites tracées avec le tableau et j'ai appliqué la loi de Beer Lambert en isolant C, qui correspond a Vi. On connait les coef directeurs des courbes et aussi le coefficient e, que j'ai converti en L.mmol.cm-1, ce qui donne 8,8 L.mmol.cm-1. Est ce correct ?
Ah et voilà le tableau a partir duquel j'ai tracé les 5 courbes
Dernière modification par Bananzo ; 26/04/2020 à 22h48.
Bonjour,
J'ai trouvé deux problèmes dans vos calculs :
La vitesse dont on parle c'est la vitesse initiale, donc la tangente à l'origine de DO(t) ou la droite passant par les premiers points. En faisant cela on a une courbe V(S) qui ressemble davantage à une loi de Michaëlis.
Les concentrations sont à diviser par 10 : on place 0,3 mL de solution dans 3 mL.
Bonjour,
Je ne comprends pas trop pourquoi il faut faire la tangeante a la courbe.... dans une vidéo explicative,je crois que le prof n'utilise pas de tangeante,
Quant aux volumes, le prod a dit dans un mail de ne pas s'en préoccuper car ce sont des données experimentales, dois-je quand même diviser les concentrations ?
Merci d'avance
Dernière modification par Bananzo ; 27/04/2020 à 10h14.
J'ai dit tangente OU premiers points, le prof utilise peut-être les premiers points. Lien vers la video ?Envoyé par Bananzo
Parce qu'on veut la vitesse initiale
Il n'a pas du dire exactement cela ... sinon cela voudrait dire que la vitesse avec des espèces de concentration c serait la même qu'avec une concentration c/10 !
Si vous ne divisez pas par 10, votre Km sera multiplié par 10. Donc votre Km serait de 14,7 mmol/L. Est-ce plus raisonnable ?
Ce n'est pas la peine de prendre les premiers points, auparavant j'avais aussi pensé à cela mais dans un mail que je lui ai envoyé, il m'a dit que toutes les données étaient déja en phase exponentielles."Les données sont déjà en phase exponentielle, à garder en tête : phase exponentielle = droite". Le truc pour la vidéo c'est que c'est une vidéo "maison", il n'y a pas de lien.....
Et voici ce qu'il dit pour le volume :
"Notez que certaines données ne sont pas utiles comme le volume de substrat et le volume final ce sont des données d'expériences uniquement" Effectivement, il parlait des volumes finals et non de ceux dont vous parliez.
Si j'ai bien compris, il faut diviser la concentration par 10 car le rapport Volume de substrat/Volume final =10, le 14,7 mmol/L me semble juste mais pouvez vous m'expliquer comment introduire ce facteur 10, puisqu'on est censé lire le Km avec l'équation de la courbe ? Et par la même occasion pouvez vous l'expliquer votre raisonnement ?
Merci d'avance
Il y a un problème d'incompréhension : on ne parle peut-être pas de la même chose, je pensais que vous aviez une cinétique type Michaëlis, avecformule dans laquelle v désigne la vitesse initiale correspondante à la concentration introduite (donc initiale) S.
Dans ce cas, la courbe pour 0,5 mmol/L donne
Sur laquelle on voir que confondre vitesse initiale et vitesse moyenne est grossier.
Mais peut-être que votre étude ne correspond pas.
"Notez que certaines données ne sont pas utiles comme le volume de substrat et le volume final ce sont des données d'expériences uniquement"
Là je ne comprends vraiment pas : ce que je croyais est que vous faisiez le mélange et mesuriez l'avancement avec le spectro et donc que la cinétique avait lieu "dans le spectro" avec la concentration de la cuve dans le spectro.
Là encore, votre étude ne correspond peut-être pas à cela.
Si dans une étude expérimentale, il n'est pas la peine de tenir compte des données d'expériences ...
"phase exponentielle = droite" : il me parait difficile de dire que la courbe ci-dessus est une droite.
D'après mon interprétation (fausse d'après ce que dit votre prof), vous prenez 0,3 mL de substrat à 8 mol/L auquel vous ajoutez l'enzyme pour un volume total de 3 mL et ensuite cela réagit dans le spectro. Lors de la réaction la concentration en substrat est bien de 0,8 mmol/L.
Pour ce qui est de la valeur de Km, en supposant mon raisonnement correct, si on introduit dans les données X=8 alors que (S)=0,8, cela revient à dire que la variable X=10*(S).
La loi en inverse est
Ceci étant mon raisonnement de départ était plus simple
Pour les données en phase exponentionelle j'ai eu confirmation du prof sur le faite que toutes les données du graphique des DO en fonction des concentrations étaient en phase exponentielle
Le problème est peut-être alors que je ne comprends pas " DO en fonction des concentrations étaient en phase exponentielle", quelle est la signification exacte de cette phrase ?
D'autre part, comment déterminez-vous la vitesse : j'avais l'impression que c'était c(t) linéarisée et que vous preniez la pente. Vu votre remarque sur exponentielle=droite, est-ce que vous faites une anamorphose du type ln( c ) ou autre ?
J'ai trouvé pour les phases exponentielles, cela concerne des lois croissance de bactéries, biomasse avec une loi de Monod de même expression que Michaëlis. Est-ce cela dont il s'agit ?
A lire l'intro, je dirai non, n'y aurait-il pas deux exos en même temps et confusion entre les deux ?
Ce que j'ai compris : Les données du tableau avec les Do et le temps sont déja en "phase exponentielles" d'après le prof. Après a partir de toutes ces courbes, on trace leur courbe de tendance puis on determine leurs coef directeurs avec leurs équations, pour avoir les DO puisque pour avoir les Vi on utilise la loi de Beer Lambert où on pose c=Vi, et on connait l=1cm, e=8,8 et les DO sont les coef dircteurs calculés précedemment. Puis on trace une courbe de saturation avec en abscisse la concentration et en ordonnée les Vi. Puis on fait l'inverse de toutes les données utilisées pour tracer la courbe de saturation. Apres on determine le Km et Vm. Le problème étant que j'obtiens un Km de 147
Si j'ai compris :
- vous tracez DO=f(t) et vous cherchez la droite DO=pente*t+a, la pente vous donne la vitesse en unité DO/min
- vous convertissez votre pente en unité DO en une pente en unité mol/L/min=Vi
- vous tracez Vi=f(S0) avec S0 concentration introduite en substrat
- vous tracez 1/Vi=f(1/S0) et ordonnée à l'origine 1/Vmax et abscisse à l'origine -Km (ou pente Km/Vmax)
Est-ce bien cela ?
Oui c'est exactement cela
Donc si c'est bien cela, comme la relation de Michaelis fait intervenir la vitesse initiale, il faut prendre les premiers points. cf. cinetique-des-enzymes-michaeliennes
Je ne sais pas, non pas que je vous contredise mais, le prof n'a pas mentionné de ne prendre que certaines données
Il ne s'agit pas de savoir si le prof n'a pas mentionné de ne prendre que certaines données, mais de connaitre la signification de la relation de Michaelis.
Attendez, je crois que nous ne sommes pas dans le cas d'enzymes michaeliennes, quand je trace la courbe de saturation je n'ai pas une courbe de type exponentielle, est ce dû au fait que je n'ai pas pris les premiers points ou que nous ne sommes pas dans le cas où il faut utliiser cette relation ?
Cela ne m'étonnerait pas puisque l'exercice suivant traite de l'exploitation de la loi de Michaelis
Cela expliquerait en effet beaucoup de choses, et vous pouvez oublier tout ce que j'ai dit.
Mais j'avais posé cette question dans le message #17
La courbe de saturation (dans le cas Michaelis) n'est pas une exponentielle mais une hyperbole et c'est bien ce que l'on observe :
Mais alors si votre courbe en double inverse ce n'est pas Michaelis, c'est quoi ? loi de Monod ? autre chose ?
Il se peut que je sois complètement à côté.
A vrai dire, après avoir vu le modèle de Monod, j'ai vu que cela ne correspondait pas non plus, en fait ça ne correspond à rien.
je vous envoie ma courbe de saturation et ma représentation des doubles inverses, s'il n'y avait pas de titre on ne ferait pas la différence...
Voici deux liens sur des TP trypsine :
edu.upmc.fr
unige.ch
