HPLC en phase inverse pour molécules polaire ? Ou méthode HILIC ?

[pharma2016]

Bonjour,

Je travaille sur le dosage du 5-fluorouracile et ses impuretés de dégradation ( Acide barbiturique, 5-hydroxyuracile, et Urée). Je dois pouvoir doser ces composés par la même méthode. La méthode que je trouve dans la pharmacopée européenne pour le dosage des impuretés ( à part l'urée), c'est la chromatographie liquide en phase inverse. Or, si j'ai bien compris, la HPLC en phase inverse c'est pour les molécules non polaire, et pour les molécules polaires il faut privilégier la méthode HPLC en phase normale ou la méthode HILIC.

J'ai plusieurs questions sur ce sujet :

1) Pourquoi on utilise la méthode HPLC en phase inverse dans la plupart des articles scientifiques et la pharmacopée et pas la méthode HILIC ou en phase normale, j'ai beau chercher mais je ne trouve rien comme explications. J'ai même lu dans un article que le 5-fluorouracil ne peut pas être dosé par la HPLC en phase inverse car c'est une molécule extrêmement polaire.

2) Pourquoi on ne dose pas l'urée par cette méthode ? Et est-ce que cette molécule est dosable par la HPLC couplé au détecteur UV ? Car je vois dans certains articles écrit " L'urée n'absorbe pas dans l'UV" et puis dans sa monographie je vois qu'il peut être dosé par HPLC à une longueur d'onde de 190 nm avec un détecteur UV.

3) Quel méthode me conseillerez-vous pour doser toutes ces molécules ? Je pensais à les doser par la méthode HILIC, mais je suis un peu perdu, je suis toujours étudiante et c'est la première fois que j'élabore une méthode donc j'ai peur de faire des bêtises

Ca m'aiderait énormément si quelqu'un pouvait répondre à mes questions,
Merci d'avance.

Bonne Journée.
-----

[Kemiste]

Bonjour.

L'HPLC n'est pas réservée aux molécules apolaires. On peut très bien utiliser l'HPLC pour des molécules polaires (c'est ce qui est généralement fait en routine). On trouve des méthodes HPLC quand on tape "5-fluorouracile HPLC" dans Google. Ta séparation va dépendre de ta colonne (il existe beaucoup de phases stationnaires différentes) et de ton éluant (composition, gradient, tampon...). Le mode HILIC est à privilégier pour des cas particuliers comme des molécules très polaires ou des sels.

[pharma2016]

Donc si j'ai bien compris je dois bien faire une HPLC en mode inverse comme écrit dans la pharmacopée ? Le problème c'est que l'urée n'est pas retenue sur la colonne C18, donc je pensais à faire une dérivatisation de l'urée avec p-dimethylaminobenzaldehyde. Mais comme on a plusieurs composés à analyser dans ma solution, je me posais la question si je peux directement ajouter le p-dimethylaminobenzaldehyde dans ma solution à analyser ? Est-ce que p-dimethylaminobenzaldehyde va uniqument réagir avec l'urée ou il y a des risques qu'il réagisse aussi avec les autres composés ?

[Kemiste]

Je ne sais pas quelles sont les conditions pour l'analyse de l'urée par HPLC. Tu dis que la C18 ne retiens pas l'urée mais il existe, comme je l'ai indiqué, de très nombreuses phases stationnaires en HPLC et des "C18" de nature différentes. Il faudrait voir dans la biblio ce qui est décrit.

Quelle est la nature de ton échantillon ? As-tu seulement les 4 composés que tu cites en solution ? Si les 4 composés sont séparés et que seule l'urée n'est pas retenue serait-ce acceptable pour ton dosage ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[pharma2016]

Si j'ai bien compris, la raison pour laquelle l'urée ne sera pas retenue en mode inverse, c'est parce que c'est une molécule très polaire et elle ne sera pas retenue du tout sur la phase stationnaire.

Je dois faire un travail sur une crème à base de 5-fluorouracile, et je dois trouver une méthode pour doser les impuretés de dégradation et le 5-fluorouracile. Je dois pouvoir toutes les doser avec la même méthode.

Les paramètres dans la pharmacopée européenne pour doser les impuretés : (On dose toutes les impuretés du 5-fluorouracil par cette méthode mais pour l'urée on utilise une CCM).

Colonne :
– dimensions : l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm,
– phase stationnaire : gel de silice octadécylsilylé pour chromatographie R (5 μm). ( Phase Inverse)C18
Phase mobile : solution de phosphate monopotassique R à 6,805 g/L ajustée à pH 5,7 ± 0,1 avec une solution d’hydroxyde de potassium 5 M préparée avec de l’hydroxyde de potassium R.
Débit : 1,0 mL/min.
Détection : spectrophotomètre à 266 nm.
Injection : 20 μL.
Température : Ambiante.

[sfnsfn2]

Bonjour,

" 1) Pourquoi on utilise la méthode HPLC en phase inverse dans la plupart des articles scientifiques et la pharmacopée et pas la méthode HILIC ou en phase normale, j'ai beau chercher mais je ne trouve rien comme explications. J'ai même lu dans un article que le 5-fluorouracil ne peut pas être dosé par la HPLC en phase inverse car c'est une molécule extrêmement polaire. "

Le choix d'une technique chromatographique dépend de la nature des composés à analyser. Pour avoir une rétention, la phase stationnaire doit avoir la même nature que ces composés : polaire-polaire ou apolaire-apolaire. Dans le cas contraire, ils existent plusieurs techniques pour assurer la rétention : dérivatisation ou l'ajouts de paire d'ions qui est la plus utilisée. La plupart des des principes actifs sont des composés hydrophobes, ce qui les rendent facilement retenus en RPLC. Dans certains cas, on trouve des méthodes en phase normale NPLC ou HILIC. L'avantage de la RPLC est le large choix et disponibilité de phases stationnaires et phases mobiles. Dans le cas du 5-fluorouracil, selon la pharmacopée, c'est une phase inverse mais la phase mobile est une solution 100% aqueuse sans aucun solvant organique. Donc sa force d'élution est faible ce qui donne une certaine rétention.


" 2) Pourquoi on ne dose pas l'urée par cette méthode ? Et est-ce que cette molécule est dosable par la HPLC couplé au détecteur UV ? Car je vois dans certains articles écrit " L'urée n'absorbe pas dans l'UV" et puis dans sa monographie je vois qu'il peut être dosé par HPLC à une longueur d'onde de 190 nm avec un détecteur UV. "

190 nm n'est pas très spécifique puisque à cette longueur d'onde, la phase mobile absorbe, ce qui diminue la sensibilité de détection. On trouve dans certaines monographies que les impuretés ne sont pas analysées par différents techniques pour des problèmes d'analyses : toxicité de l'impureté, ses propriétés (volatilité, absorption en UV, faible résolution...)


" 3) Quel méthode me conseillerez-vous pour doser toutes ces molécules ? Je pensais à les doser par la méthode HILIC, mais je suis un peu perdu, je suis toujours étudiante et c'est la première fois que j'élabore une méthode donc j'ai peur de faire des bêtises "

La HILIC peut te résoudre ce problème, il suffit de faire une bibliographie et des essais. Ton problème majeur est comment détecter l'urée qui n'absorbe pas dans ce mélange. Si tu as un détecteur MS ou ELSD, c'est parfait sinon tu peux coupler un UV avec un IR mais ce dernier manque de sensibilité.