Localisation subcellulaire d'une protéine

[invitecb6ab57e]

Bonsoir à tous,je viens ici pour que vous m'éclairiez de vos lumières savantes!!
J'ai un exercice de biologie moléculaire et je bute dessus!!
On veut étudier le trafic intracellulaire d'une enzyme pancréatique E en réponse à un traitement à l'hormone H.
ON étiquette E avec une séquence FLAG contre laquelle on a un Ac de haute affinité..Clonage de l'ADN dans un vecteur pSV FLAG qui contient le promoteur du SV40 et une séquence codante pour le FLAG.

Quelles précautions il faut prendre pour réaliser ce sous clonage :
J'avais pensé à : amplifier avec des amorces spécifiques pour constituer notre banque d'ADNc, utiliser des bacdtéries compétentesavoir un test de sélection pour nos bactéries ayant intégré le plasmide (donc que le plasmide contienne un gène de résistance à un antibiotique), utiliser, pour la digestion, deux enzymes différentes pour éviter les pb d'orientation du fragment insert, faire un traitement à la phosphatase alcaline pour éviter que le vecteur ne se recircularise..
Désolé c'est pas dans l'ordre mais j'ai mis comme ça arrivait!!!Je vois pas d'autres moyens pour être sûr que ce sous clo fonctionne...mais si vous avez des idées!!

On suspecte que l'E,étant très protéolytique, est couplé à une molécule inhibitrice.
Pour étudier cela on transfecte des cellules pancréatiques avec notre plasmide pSV-E-FLAG et on fait une étape de co-immunoprécipitation..

On a trois contrôles: un puit où on met un plasmide pSV-E-FLAG non transfecté ds une cellule pancréatique : on observe une bande correspondant aux Ig G
Un puit où c'est un pSV-GAPDH-FLAG qui a été transfecté..on a une bande pour la GAPDH-FLAG et une bande pour les Ig G...Ca je comprends!!
Un puits où les anticorps ont été omis..Pas de bandes, normal!!!

Et notre puits test où on observe, bande pour Ig G, pour E-FLAG et une bande X et l'on cherche à savoir ce que c'est...

Est ce que les Ig G sont naturellement présentes dans les cellules pancréatiques mais pq on les observe dans le gel?Si elles étaient la protéine à laquelle notre anticorps anti FLAG se fixe lors de la co-immuno, on ne devrait pas les observer sur le gel?D'où viennent elles?L'anticorps anti FLAG se fixe dessus alors puisque lorsqu'on le met pas, il n'y a pas de bandes correspondant aux IgG!!!!Mais pourquoi sont elles là et révélées?

GAPDH est un housekeeping gene non?Il permet de vérifier la qualité de notre WB?

Pour X, c'est clair que l'Ac antiFLAG se fixe dessus,donc il comporte une séquence FLAG, ou un bout..On a aussi une bande E-FLAG qui est reconnue, normal puisque la construction interagit avec les Ac anti FLAG..Mais alors ça voudrait dire que X provient d'un "truc" où il y a du FLAG, donc notre construction E-FLAG??Ce qui voudrait dire que qqchose l'a coupé en deux morceaux contennat chacun du FLAG et donc potentiellement reconnaissable par l'Ac??

Je sais c'est trèèès long..Mais c'est le fouilli total j'ai besoin d'aide!!

Je vous remercie infiniment!!!!Bonne soirée et merci d'avance!
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[Flyingbike]

faire un traitement à la phosphatase alcaline pour éviter que le vecteur ne se recircularise..

pas besoin en général si tu utilises 2 enzymes différentes pour la digestion, mais c'est bien d'y avoir pensé

GAPDH est un housekeeping gene non?Il permet de vérifier la qualité de notre WB?

d'apres ce que j'ai compris, ce n'est pas un wb puisqu'on voit toutes les protéines immunoprécipitées. GAPDH est en effet utilisé souvent pour normaliser etc. mais dans ce cas je pense que c'est pour s'assurer que la protéine X immunoprécipitée intéragit spécifiquement avec E

Est ce que les Ig G sont naturellement présentes dans les cellules pancréatiques mais pq on les observe dans le gel?Si elles étaient la protéine à laquelle notre anticorps anti FLAG se fixe lors de la co-immuno, on ne devrait pas les observer sur le gel?D'où viennent elles?L'anticorps anti FLAG se fixe dessus alors puisque lorsqu'on le met pas, il n'y a pas de bandes correspondant aux IgG!!!!Mais pourquoi sont elles là et révélées?

IgG = an***o**s

Pour X, c'est clair que l'Ac antiFLAG se fixe dessus,donc il comporte une séquence FLAG, ou un bout..On a aussi une bande E-FLAG qui est reconnue, normal puisque la construction interagit avec les Ac anti FLAG..Mais alors ça voudrait dire que X provient d'un "truc" où il y a du FLAG, donc notre construction E-FLAG??Ce qui voudrait dire que qqchose l'a coupé en deux morceaux contennat chacun du FLAG et donc potentiellement reconnaissable par l'Ac??

Flag est une séquence protéique totalement artificielle. Dans cette IP, on précipite E-flag avec un anticorps qui produit des complexes avec ses antigènes (E-flag) et tout ce qui intéragit avec. Normalement, on devrait réaliser un WB sur les protéines immunoprécipitées mais visiblement ce n'est pas le cas et on se contente de visualiser toutes les protéines sur un gel. Ca serait pas mal d'avoir la figure parce qu'on ne peut pas dire grand chose de plus que : une protéine X intéragit bien avec l'enzyme E.

[invitecb6ab57e]

Bien sûr que les Ig G sont des anticorps!!Mais là ce qu'on utilise pour révéler la E-FLAg c'est un anticorps anti-FLAG...Donc qui ne peut pas intéragir avec les Ig G.....donc elles interagissent averc quoi pour être révélées??

Ensuite pour le WB autant pour moi j'ai mal lu...!!!

La figure c'est simplement différents profils...C'est un dessin en gros!!

Notre puit, on a dans l'ordre une bande pour X, une pour EFLAG et une pour les Ig G..
Pour le puit avec la construction GAPDH FLAG, on a une bande tout en haut du dessin, une pour les Ig G et c'est tout.

On cherche à savoir pourquoi on observe une bande X et à quoi elle corres^pond..A part dire qu'elle contient la séquence FLAG et que comme la seule chose qui contient du FLAG c'est E,à part dire que l'enzyme est clivée par un truc qui libére une partie de l'enzyme avec du FLAG dessus...
Et encore non, parce qu'on devrait avoir un bout avec du FLAG, un bout avec que de l'enzyme..Logiquement!!

Danqs ce cas là lors de la co-immuno on a notre protéine A (sur des billes sépharose) qui interagit avec la partie Fc de l'anti FLAG qui intergait avec autre chose...!!!Et cet autre chose est révélé par l'Ac antiFLAG...C'est bizarre non?