Bonjour
Je rencontre un problème lors d'une manip de bio mol, je me demande si qqun a déjà eu ce type de résultat...
Voilà je digère PCDNA3 avec NheI, je dénature 20 min à 65°C, je blunte avec la Klenow+dNTPs, j'ajoute de l'EDTA et je dénature 20 min à 75 °C comme indiqué dans le protocole d'utilisation de la Klenow. Et là je fais migrer sur gel d'agarose et... tout reste dans mon puit, comme précipité!J'ai du coup regardé à chaque étape (car notons que je faisais en parallèle exactement la même chose sur un autre vecteur qui contient mon insert et là ça a marché), et il s'avère que c'est la dernière étape de chauffage qui est fatale à mon ADN...
Savez-vous pourquoi? Je pense donc purifier directement mon vecteur sur colonne sans dénaturer la Klenow, mais je veux faire ensuite une autre digestion, pensez-vous qu'il puisse rester de la Klenow associée à mon ADN et qui pourrait donc interférer avec la suite de ma manip?...
Merci d'avance!
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Envoyé par Delphinette 