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Problème après digestion/Klenow/dénaturation



  1. #1
    Delphinette

    Problème après digestion/Klenow/dénaturation


    ------

    Bonjour
    Je rencontre un problème lors d'une manip de bio mol, je me demande si qqun a déjà eu ce type de résultat...
    Voilà je digère PCDNA3 avec NheI, je dénature 20 min à 65°C, je blunte avec la Klenow+dNTPs, j'ajoute de l'EDTA et je dénature 20 min à 75 °C comme indiqué dans le protocole d'utilisation de la Klenow. Et là je fais migrer sur gel d'agarose et... tout reste dans mon puit, comme précipité! J'ai du coup regardé à chaque étape (car notons que je faisais en parallèle exactement la même chose sur un autre vecteur qui contient mon insert et là ça a marché), et il s'avère que c'est la dernière étape de chauffage qui est fatale à mon ADN...
    Savez-vous pourquoi? Je pense donc purifier directement mon vecteur sur colonne sans dénaturer la Klenow, mais je veux faire ensuite une autre digestion, pensez-vous qu'il puisse rester de la Klenow associée à mon ADN et qui pourrait donc interférer avec la suite de ma manip?...
    Merci d'avance!

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  3. #2
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Problème après digestion/Klenow/dénaturation

    Tu laisses ton tube redescendre à room temp avant de déposer ? ton peigne de gel est bien propre ?

  4. #3
    Delphinette

    Re : Problème après digestion/Klenow/dénaturation

    Oui j'ai laissé redescendre la température, peut-être pas assez (!?) (en mm tps ça fait maintenant 3 fois que j'ai le résultat, donc c'est reproductible!) et je ne pense pas avoir de problème avec le peigne car avec mon test sur un aliquot à chacune des étapes de la manip, j'ai une belle bande correspondant à la taille du vecteur pour chacune des étapes, sauf pour le puit correspondant à cette dernière étape de chauffage...

  5. #4
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Problème après digestion/Klenow/dénaturation

    étrange. Tu comptes purifier ton vecteur sur gel ? si oui, évites d'inactiver la klenow, mets juste l'EDTA ca devrait aller.

  6. A voir en vidéo sur Futura
  7. #5
    Delphinette

    Re : Problème après digestion/Klenow/dénaturation

    Oui j'ai pas fait la dénaturation de la Klenow du coup, j'ai purifié direct sur colonne, et ensuite j'ai fait ma 2e digestion et purifié sur gel. On verra bien si ma ligation fonctionne comme il faut...
    Vraiment bizarre ce truc quand même!?

  8. #6
    Flyingbike
    Modérateur

    Re : Problème après digestion/Klenow/dénaturation

    Citation Envoyé par Delphinette Voir le message
    Oui j'ai pas fait la dénaturation de la Klenow du coup, j'ai purifié direct sur colonne, et ensuite j'ai fait ma 2e digestion et purifié sur gel. On verra bien si ma ligation fonctionne comme il faut...
    Vraiment bizarre ce truc quand même!?
    y'a pas de raison que ça ne marche pas, deja avec l'edta la klenow est HS. Bonne chance !

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