[Biologie moleculaire] pb clonage : Klenow

[katiaestelle]

Lorsqu'on "remplie à la klenow" un site EcoRI et qu'on fait une ligation de ce fragment avec une extrémité issu d'une digestion par pvuII, est ce qu'on obtient un nouveau site EcoRI??? C'est ce qu'il y a marqué (à moins que mon niveau d'anglais me trahisse, ce qui est tout à fait possible) dans une publi :
"...a 670-bp PvuII fragment of plasmid1 was cloned into plasmid2. This fragment was ligated into plasmid2 which had been digested with EcoRI and filled in with Klenow fragment. The filled in EcoRI-PvuII junctions regenerate EcoRI sites..."
J'ai retourné les séquences des sites de restriction dans tous les sens mais je ne vois pas comment on peut reconstituer un site EcoRI comme ça... est-ce que je me trompe? Je ne connais pas très bien cette reaction de fill-in, peut-être que je me trompe dans mon raisonnement.
merci!!!
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[piwi]

Le site EcoRI c'est
GAATTC
CTTAAG (je fais dans le lagorieux car tout le monde ne connait peut être pas ses séquences de restriction.
Quand l'enzyme coupe le site tu auras
G
CTTAA
et
AATTC
........G


Donc si tu remplis à la Klenow tu auras:
GAATT
CTTAA
et
AATTC
TTAAG

Et tu ne reconstitues pas ton site de restriction puisqu'il te manque le C/G à la "fin"

Mais si tu ligues avec PvuII tu auras
GAATTCTG
CTTAAGAC

Et là c'est bon!
Cordialement,
piwi

[inviteb73ce398]

Et tu ne reconstitues pas ton site de restriction puisqu'il te manque le C/G à la "fin"

Sauf si tu "amenes" le C/G avec une emzyme qui coupe "blunt", genre PvuII.

[piwi]

arf arf arf.......
J'ai appuyé trop vite sur le petit bouton tout à l'heure mais j'ai eu vite fait de remettre ce qui manquait.

[A voir en vidéo sur Futura]