Localisation de protéines dans la cellule

[MasterCobra]

Bonjour tout le monde,

Je ne vous réécrirais pas toute la question de mon devoir, parce qu'il y en a pour des pages et des pages... En gros, ça dit:
"Vous êtes doté d'une protéine dans votre hippocampe vous conférant une mémoire supérieure que celle des autres membres de votre famille (si seulement c'était vrai, l'anatomie serait beaucoup plus facile!). Vous voulez déterminer sa localisation exacte dans vos cellules". En fait, tout le monde possède cette protéine, c'est seulement que "chez moi" elle a une différente forme, me rendant un mutant de Xmen.

Alors, pour la question : quel modèle cellulaire et pourquoi, la réponse m’apparaît évidente: utilisons des cellules de l'hippocampe, il est écrit nulle part que cette protéine est exprimée ailleurs que dans l'hippocampe.

Quelle méthode pour localiser la protéine? Je pensais y aller pour un marquage immunochimique avec fluorochrome, je pense que c'est la meilleure voie, parce que des échantillons des deux protéines (normale et "supérieure") me sont fournis.

Ma question principale est: pour isoler des anticorps, j'injecte un animal avec la protéine, elle produit des anticorps qui, je suppose, sont solubles dans le plasma. Alors, j'isole le plasma et par chromatographie d'affinité sur colonne je suis en mesure d'isoler mes anticorps contre la protéine en question? Par cette voie, j'espérais me passer de tout le tralala des anticorps polyclonaux/monoclonaux qui prend des semaines à faire... (Mais je n'ai probablement pas raison, car il y aura seulement qu'une très faible concentration d'AC dans le plasma, rendant impossible le marquage par manque d'AC?)

Ensuite on couple l'AC primaire avec un AC secondaire (produit le la même façon, seulement le fait que c'est maintenant l'AC primaire qui est injecté, dans un autre animal, qui agit comme AG et tout le tralala). Cet AC secondaire est couplé avec une molécule fluorescente.

Finalement, on fixe les cellules. On incube avec l'AC primaire. On lave. On incube avec l'AC secondaire marqué. Magie, la protéine s'illumine. (Question stupide... comment est-ce que des protéines intracellulaires se marquent. Les ACs traversent les membranes?)

Est-ce que mon raisonnement est bon? Des nouvelles idées seraient grandement appréciées!

Merci,
Julien
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[Flyingbike]

Votre énoncé n'est pas très clair... Cette "mémoire supérieure" est elle due au fait que votre protéine s'exprime là où elle ne devrait pas ? Ou bien elle s'exprime avec un pattern (je ne retrouve pas le terme français) normal mais elle porte une mutation modifiant sa fonction ?

D'autre part, est ce que cette protéine est connue ?

[MasterCobra]

Non non, c'est purement fictif comme problème. Selon l'énoncé, je suis doté d'une mémoire supérieure seulement car une certaine protéine X est exprimé "sous une différente forme" que chez les autres humains. Elle est localisée à la même place, seulement que la séquence d'acides aminés diffère un peu.

Le but de ce devoir est d'élaborer différents protocoles afin de déterminer où la protéine se situe dans les cellules de l'hippocampe (membrane, cytoplasme, etc...), d'où tout le tralala avec les anticorps et la microscopie fluorescente.

Merci
Julien

[piwi]

Bonsoir,

La notion de forme différente est assez vague. Est un repliement 3D qui change, ou alors la séquence (des exons en plus/en moins). Au final, ce que va reconnaitre un anticorps, c'est l'agencement 3D des acides aminés de surface de la protéine. Bon, peu importe après tout!

Une stratégie de purification serait :
1. précipiter avec la protéine sauvage et garder le surnageant (ce qui ne va pas marquer la protéine sauvage)
2. précipiter avec la protéine mutante et garder l’élua (ce qui reconnait la protéine mutante)

A priori, on devrait avoir un anticorps qui ne reconnait pas la protéine native, mais seulement la protéine mutante. Après, la question qui va se poser c'est quelle stratégie de production pour l'anticorps. Si le domaine modifié est grand, on peut essayer une stratégie de polyclonal. Si seulement un seul acide aminé change et que la conformation 3D est bien préservée, il faut peut être tenter un monoclonal et tester les clones un à un en ELISA ou WB.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

la réponse de piwi est rigoureuse et est une bonne base. Il y a plus simple selon les informations que vous avez, par exemple si vous avez cette fameuse séquence, on peut produire un anticorps à partir de peptides de synthèse.

[MasterCobra]

Merci beaucoup tout le monde, je crois que je vais bien réussir cet exercice grâce à vos conseils!