réalisation d'un western blot

[tsuki93]

Bonjour à tous, j'ai réalisé mon premier western blot cette semaine et il nous a été posé une question de reflexion à laquelle je n'arrive pas à répondre:

"Imaginons que vous travaillez sur la protéine HYAL1 (55kd) durant le stress oxydatif. Vous avez deux conditions: des cellules controles et des cellules traitées par H2O2. Pour connaitre l'abondance de HYAL1 durant un stress oxydatif vous allez réaliser un western blot (contrôle de charge: actine 43kd) avec un tout nouvel anticorps jamais testé (produit par Santa Cruz).
Quels sont les paramètres importants que vous allez devoirs contrôler pour cette manip?"

Voilà, alors je suppose qu'il faut multiplier les contrôles , par exemple pour s'assurer que l'anticorps secondaire fixe bien l'anticorps primaire, mais je dois avouer que j'ai vraiment du mal avec la mise au point des contrôles, donc si quelqu'un à une idée, je lui en serait très reconnaissante
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[camulus]

Salut,

Je pense que le principal contrôle consiste à s'assurer de la spécificité de l'anticorps. Pour ce faire vous devrez faire un western sur des lysats de cellules qui sont KO ou Knock down pour HYAL1. Si dans ces conditions vous n'avez pas de signal et que dans des condition avec cellules WT vous avez un signal vous pourrez conclure sur la spécificité de l'anticorps.

Camu

[tsuki93]

merci beaucoup pour la réponse!
Je pense qu'il faut aussi déterminer expérimentalement la concentration idéale de l'anticorps, et ne pas juste se fier aux instructions fournies par les firmes, mais je ne suis pas certaines que tous les labos prennent la peine de le faire.