Southern Blot, Northern Blot et Western Blot

[Neymar75]

Salut à tous , je suis actuellement en PACES et j'ai vu en biologie cellulaire les trois techniques que sont le Southern blot le Northern blot et le Western blot alors voilà je sais que cela sert respectivement à l'étude de l'ADN, de l'ARN et des protéines.
Toutefois j'ai un petit problème de compréhension quant à leur but ainsi qu'à leur principe de fonctionnement. En effet, je pense que le but est de vérifier la présence, par exemple dans le cas de la Southern blot, d'une séquence particulière d'ADN mais je ne suis vraiment pas sur.
Si quelqu'un pourrait m'expliquer ce serait cool ( surtout le principe de fonctionnement)
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[blisax]

Bonsoir,

Bienvenu sur le forum ! Il faut déjà dire que le southern blot est un peu dépassé alors je prendrais plutôt l'exemple du western blot (mais c'est la même chose, tu n'auras pas de mal a faire la comparaison).
Le but est bien de vérifier la présence d'une protéine (dans le cas du western blot) et de la quantifier (pour être exact ce n'est pas une quantification absolue mais c'est une mesure qui va permettre de comparer la quantité de la dite protéine entre deux conditions expérimentales. Est-ce qu'il y a plus de protéines dans la condition A ou dans la condition B ? On parle de semi-quantification).

Pour le principe, je vais faire simple: On fait un broyat de cellules (ou d'autres chose, ce qui compte c'est que ton matériel de base contienne les protéines que tu veux étudier). Ce broyat contenant des protéines est mis avec du SDS (Sodium-Dodecyl-Sulfate), cette molécule va "déplier" les protéines et les recouvrir de charges négatives (on parle de condition dénaturante). Souvent on ajoute aussi du beta-mercapto-ethanol (condition réductrice), cette molécule va supprimer les ponts disulfures des protéines par une réaction d'oxydo-réduction.
On met le tout sur un gel de polyacrylamide et on fait une électrophorèse: on applique un champs électrique dans ce gel. Les protéines sont recouvertes de charge + (à cause du SDS) et auront donc tendance a migrer vers la borne - du dispositif. Mais les protéines sont dans ce fameux gel de polyacrylamide qui est une sorte de maillage moléculaire, ainsi les protéines les plus légères se déplaceront plus vite que les plus lourdes. On obtient ainsi un gradient de protéines triées par leurs poids moléculaires le long de ce champs électrique. On parle de SDS-PAGE (=Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium)

Ce gel est un peu compliqué à manipuler alors on fait migrer les protéines sur une feuille de nitrocellulose sans perde l'ordre des protéines. Pour finir on ajoute des anticorps qui vont reconnaitre spécifiquement les protéines que tu veux étudier. Ces anticorps sont couplés à une sonde lumineuse, chimique, radioactive; bref quelque chose qu'on peut mesurer. Plus le signal de l'anticorps est présent plus ta protéine était présente dans ton matériel de base.

Petit exemple concret: admettons que tu travailles sur la maladie de Steinert, c'est une maladie musculaire (mais peu importe). Tu découvres une mutation sur le gène DMPK chez les patients qui ont cette maladie. Une question intéressante est de savoir si la protéine DMPK est présente chez ces patients malgré la mutation ? Pour cela tu peux prendre des cellules de patients et de personnes saines et faire un western blot pour comparer la quantité de protéine DMPK dans ces deux conditions. En l’occurrence tu trouveras probablement que les patients ont beaucoup moins de protéines DMPK que les personnes saines. Si tu veux pousser plus loin, tu peux mesurer la quantité d'ARNm par northern blot pour voir si la mutation a un effet avant ou après la traduction... C'est juste un exemple, le western blot ne sert pas que ce type de cas. J'espère que le principe et la méthode est un peu plus clair ?

[Neymar75]

Merci beaucoup entre temps je me suis renseigné et javais donc compris mais merci quand même pour ta réponse . Toutefois ce n' est pas les protéines charger négativement qui migrent du - vers le + ?

[blisax]

Oups merci de me le faire remarquer: les protéines sont recouvertes de charge - et migrent bien vers le pôle + !

[A voir en vidéo sur Futura]

[Neymar75]

Ok merci en tt cas mdrr