CLONAGE - plasmide circulaire après ligation

[madabeach]

Bonjour à tous,

Je bute sur un exo.
Alors je vous remercie pour votre aide d'avance.

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Soit le fragment d'ADN de 1 200 paires de bases (pb) et dont seules les extrémités sont représentées de façon détaillée dans la figure ci-dessous. Les positions de sites de restriction BamHI et Pvu
II sont indiquées avec un nombre entre parenthèses, correspondant à la position du 1er nucléotide de chaque site

(image 1)Sans titre.jpg

Au sein de ce fragment, la flèche grisée contient une séquence bornée par un ATG et un codon Stop, codant une protéine X. Afin de cloner cette séquence dans le vecteur plasmidique décrit ci-dessous, ce fragment est digéré par l'endonucléase de restriction BamHI, dont le site de reconnaissance est le suivant :

5'-G|GATCC-3'

1/ Représentez le plus grand fragment d'ADN obtenu lors de l'hydrolyse totale du fragment de 1 200 pb par l'endonucléase BamHI,en précisant l'orientation de chacun des brins et la nature des extrémités ainsi générées

Le produit de digestion est alors incubé en présence de l'ADN ligase du bactériophage T4,
d'ATP et du vecteur plasmidique pCL203, lui-même préalablement digéré par'endonucléase BamHI

plasmide.jpg

2/ Quels sont les différents plasmides circulaires pouvant être formés après ligation? (NB :aucun schéma n'est demandé avant la réponse à la question 9)
Des bactéries compétentes E. coli sont transformées par les produits de la ligation obtenus,puis les cellules transformées sont sélectionnées sur un milieu nutritif gélosé.

3/ Quel composé doit-on ajouter au milieu nutritif pour la sélection des bactéries transformées? Justifiez votre réponse.

Trois clones bactériens sont sélectionnés et mis en culture dans un milieu nutritif liquide.L'ADN plasmidique de chacun de ces clones est extrait puis soumis à une digestion par l'enzyme de restriction EcoRI seule, ou associée à l'enzyme de restriction PvuII (digestion double).

Les produits de digestion obtenus, ainsi que les plasmides non digérés correspondants sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose natif. Les fragments d'ADN contenus dans le gel sont alors colorés, puis visualisés.

4/ Représentez très schématiquement les différents plasmides pouvant théoriquement être obtenus dans ces clones bactériens, en positionnant et numérotant les sites de restriction BamHI, EcoRI et PvuII, si besoin. Les formes multimères ne seront pas considérées.

Le gel obtenu est présenté dans la figure ci-dessous :

clone.png

5/ Compte-tenu des cartes de restriction établies à la question précédente, identifiez les
plasmides des trois clones analysés lors de l'électrophorèse ci-dessus, en justifiant votre
réponse.

6/Afin d'exprimer et de purifier la protéine X dans des bactéries, quel clone bactérien
sélectionneriez-vous? Justifiez votre réponse
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[madabeach]

Voilà ma réponse :

1/ Le fragment le plus long :

5'SORTANT-GATCCAATTATTATATGCGG-3OH RENTRANT
----3'RENTRANT-GTTAATAATATACGTCCCTAG-5'SORTANT

2/ Après je bloque, car si je l'insert comme sur la carte de restriction je n'ai qu'un seul site BamHI, je n'ai qu'un seul type de plasmide non ?

Help please

[Taz_79]

salut,

C'est un exercice de clonage et de sélection et chaque question correspond aux différentes étapes de la technique.

1/ Ta réponse est bonne. Attention n'oublie pas d'indiquer ta protéine X et tu a oublié un A au niveau du site bamHI situé en 3' de ton premier brin. Le but de cette étape est de préparer ton insert afin de pouvoir le cloner dans le vecteur plasmidique pCL203. Dans cette étape tu a excisé ton fragment d'intérêt qui a été digéré par l'enzyme BamHI. Du coup tu obtiens à chaque extrémité de ton fragment un demi-site BamHI. A savoir que deux demi-site BamHI est égale à un site de restriction BamHI.

2/ Dans ton énoncé il dise que ton vecteur plasmidique pCL203 a été préalablement digéré par l'enzyme BamHI, linéarisant ainsi ton vecteur et à chaque extrémité de ton vecteur linéarisé tu as un demi-site BamHI. Ces demi-sites vont être complémentaires à ceux de ton insert qui avait été linéariser par BamHi puis l'ADN ligase du bactériophage T4 va liguer ton insert d'intérêt dans le plasmide PCL203. On obtient donc au final un plasmide contenant ton insert. Sauf qu'en réalité dans ton tube à essai, il existe des plasmides qui se sont recircularisés en présence de la ligase sans avoir intégré l'insert. Donc après l'étape de ligation, tu obtient deux types de plasmides : ton plasmide PCL203 avec l'insert et un plasmide PCL203 sans insert.

3/ Après avoir transformées les bactéries avec ton produit de ligation, il va falloir sélectionner les bactéries qui ont intégré le vecteur PCL203, celui-ci contient une cassette de résistance à un antibiotique (Dans ton schéma, le PCL203 contient un gène codant une beta-lactamase). Pour sélectionner les bactéries ayant intégré le vecteur, il faut les cultiver en présence d'un antibiotique. Ainsi, les bactéries n'ayant pas intégré le vecteur vont mourir et il ne te restera que celles ayant intégré le vecteur.

6/ Enfin pour finir, il faut vérifier les clones bactériens car tu as deux types de plasmides : un avec insert et l'autre sans insert. Après sélection des clones bactériens, on extrait l'ADN plasmidique qui va être digéré ou non par différentes enzymes (comme dans ton schéma d'électrophorèse) afin de vérifier quel clone bactérien contient bien notre insert d'intérêt. Avec les cartes de restriction que tu as réalisé à la question 4, tu devrais pouvoir déterminer sans problème quel clone bactérien contient la protéine X.

Bonne soirée

[madabeach]

J'essaie cela et je reviens vers toi pour voir si je me suis pas gourée.

[A voir en vidéo sur Futura]

[Asesza]

Bonjours
Je me permet de vous poser une question sur cette exercice
Du coup théoriquement on doit représenter que deux plasmides l'un avec insert et l'autre sans pour ces clones bactérien ?

[Taz_79]

Normalement, oui

[madabeach]

1/Voilà ce que j'ai fais :

PROTEINE.png

Voilà ce que j'ai fais, mais je comprend pas bien ta phrase Taz_79, tu dis que j'ai oublié un A ?
mais rassure moi le site BAMH1, se coupe de façon cohésive et non pas franches hein ?

Je sais pas si tu vois ce que je veux dire ?

4/
Voilà le clone 1 que j'ai trouvé , avant de faire les deux autres clones je veux savoir si je suis dans le vrai ?

clone1.png

5/ je bloque sur la question 5 ....

[Taz_79]

Pour la première question c'est juste un petit oublie. Ton schéma est correcte et l'enzyme BamHI coupe bien de manière cohésive. Tu as marqué ceci :
5'SORTANT-GATCCAATTATTATATGCGG-3OH RENTRANT
------3'RENTRANT-GTTAATAATATACGTCCCTAG-5'SORTANT

il te manque un A (souligné en rouge)

5'SORTANT-GATCCAATTATTATATGCAGG-3OH RENTRANT
----3'RENTRANT-GTTAATAATATACGTCCTAG-5'SORTANT

Pour ce qui est de ta carte de restriction elle n'est pas suffisamment détaillée et c'est pour ça que tu n'arrives pas à faire la question 5. Il faut que tu te serves du vecteur PCL03 que l'on t'asfourni en annnexe comme base. Ensuite selon les hypothèses de la questions 2 tu y ajoute ou non l'insert. Dans tes schémas, il faut qu tu notes les sites de restrictions BamHI, EcoRI et PvuII et leurs positions exactes dans le plasmide PCL03 après ligation de l'insert. De plus la carte que tu m'a envoyé est fausse car il y a 2 sites EcoRI or normalement il n'y en avoir qu'un seul, situé juste avant le promoteur.

Pour ce qui est de la question 2, on n'obtient pas deux types de plasmides mais trois types de plasmides. J'ai été un peu trop vite en conclusion ^^. Il y a bien un plasmide sans insert insert, un plasmide avec l'insert ligué dans le bon sens et un plasmide avec l'insert ligué dans le mauvais sens. On t'indique également que l'enzyme Pvu est absent du vecteur PCL03 mais il est présent dans ton insert. Grâce à ce site de restriction et selon le sens de ton insert dans ton vecteur, on pourra répondre à la question 5.
C'est trois hypothèses correspondent aux trois clones bactériens qui ont été sélectionnés.

[madabeach]

Qu'est-ce que je peux rajouter sur ma carte de restriction ??

[Asesza]

Salut

Plus personne pour répondre ? Je bloque sur le même exercice ....
Pourriez vous ré expliquer pourquoi vous trouvez 3 plasmides à construire ?
Il n'y a pas juste le recombiné et le natif qui doivent être dessiné ? (Avec et sans insert )
Pourriez-vous aussi m'expliquer comment on construit une carte de restriction ? S'il y a une méthode simple ....je n'ai jamais réussi à comprendre et pourtant ça a l'air facile ...

Merci infiniment !

[Parawave]

Hello !

Toujours personne ?
Je bloque sur le même exercice... (questions 4/5/6).
Si quelqu'un pouvait nous éclairer...

Merci beaucoup !

[Yoyo]

Salut

Qu'est-ce qui te bloque précisément? tu ne comprends pas la question? tu ne sais pas comment faire? tu trouves une réponse bizarre?

YOyo

[Parawave]

Hello ! Merci de ta réponse !

C'est ça, je ne vois vraiment pas comment faire... J'ai essayé de regarder les exercices du même type mais j'arrive pas à faire les cartes de restriction, je sais pas comment m'y prendre !

[Asesza]

Salut
Je suis comme toi ... Je comprend pas comment on établit une carte de restriction .j'ai regardé d'autre exo et j'ai réussi à comprendre un peu mais là j'ai l'impression que c'est différent , sur le gel obtenue par exemple , on a pas la digestion simple par pvu11 ,on a celle de Ecor1 et la double digestion ....
De plus , en 2) je trouve que l'on a 2 plasmides différents recombiné et natif mais si on a trois clones ,c'est qu'il doit y avoir 3 plasmides alors ? Pourquoi ?
La question 5) nous demande d'identifier les plasmides des trois clones analysé lors de l'électrophorese ,je comprend pas ce n'est pas a partir de l'électrophorese qu'on établi les cartes de restriction ? (Donc les clones sont déjà identifié ...)
Comment les carte vont ils être utile pour sélectionner le clone bactérien qui va nous permettre d'exprimer et de purifier la protéine x
Merci de m'éclairer et me pointer mes erreurs

[Yoyo]

Hello ! Merci de ta réponse !

C'est ça, je ne vois vraiment pas comment faire... J'ai essayé de regarder les exercices du même type mais j'arrive pas à faire les cartes de restriction, je sais pas comment m'y prendre !

commencons par la question 4. Tu as identifié les différents types de plasmides qui peuvent exister?
Si oui dit moi lesquels.

Yoyo