Mecanisme de ligation SOS clonage

[invite2475de1a]

Bonjour tout le monde;
j ai deja posé des questions sur ce forum sur le clonage de mon géne d interet (le gene qui code pour la P30 ou la proteine connue sous le nom de SAG1) mais j 'ai pas eu de reponse

Ma question du jour, c'est de savoir le mecanisme d'action d'une ADN ligase en général et dans mon cas pour le clonage d'un géne d'interet dans un plasmide (PICZ) qui sont les deux digérés par les mémes enzymes de restriction (SFII et NOTI).
Au fait la j'ai vraiment besoin de votre aide car j 'arrive pas à reussir mon clonage.

j'ai obtenu mon gene d'interet (qui code pour la P30) à partir d'une ancienne construction (Plip6-p30) par double digestion ,le dosage donne 9.8 ng/ul (elution dans 30 ul).
J'ai procédé aussi par amplification de ce mm géne par PCR à partir de la mm construcution et le dosage n'est pas fameux (9.81 ng/ul dans 75 ul d'eluat aprés purif) il faut noter que les bandes correspendant au produit Pcr sont intenses sur gel d'agarose+ BET.

J'ai aussi mon vecteur (PICZ doublement digéré par ces enzymes et purifié sur colonne).
j 'ai procédé à la ligation ds les proportions 1/1, 1/3 , et1/5 mais aprés transformations ds ECOLI (top 10) , extraction plasmidique par lyse alcaline et screening par pcr......Pas de clonage. j'ai fais 3 tentative jusque la

Si vous avez des propostions ou des conseils a mes donner vous serez bien aimable j'ai hate de reussir ce clonage pour avancer dans mon sujet.

Merci ^^
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[invite2475de1a]

jamais de reponse sur ce forum

Merci qd mm

[noir_ecaille]

Patience, petit scarabée

Il faut encore que les bonnes personnes se connectent et chacun ici participe bénévolement tout en ayant des impératifs extérieurs.

Ne soyez pas défaitiste

[invite1260514a]

Pourquoi absolument ce plasmide? je ne le connais pas personnellement...

[A voir en vidéo sur Futura]

[LXR]

Il manque de nombreuses informations pour que nous puissions t'aider. As-tu fais des vérifications sur gel d'agarose après chaque étape pour vérifier la qualité et la proportion de ton matériel? la quantité d'ADN obtenu après PCR me laisse envisager que la PCR n'a pas marché... A partir de là, il ne sert à rien de continuer le sous-clonage tant que les étapes avant ligation ne sont pas bien optimisées.

En attente des réponses à mes questions. Toutefois, d'autres précisions seraient bienvenues.

[invite2fb83916]

Bonjour bonjour!

Concernant le mécanisme d'action d'une ADN ligase en général, j'ai mis en pièce jointe une animation GIF.
Cette enzyme va ligaturer deux brins d'ADN par création d'une liaison phosphodiester. Dans le cas du clonage voici les étapes nécessaires à son fonctionnement:
- Traitement du plasmide receveur avec les enzymes de restrictions, puis traitement à la phosphatase alcaline (aussi cela évitera que le plasmide se recircularise quand vous rajouterez la ligase et l'ATP!) et purification.
- Coupure de l'insert et purification
- Dosage
- Ligation ON

Pour ce qui est des proportions, c'est vraiment de la "cuisine". Pour mon dernier clonage en date, j'ai essayé d'introduire un insert de 200pb environs dans un plasmide de 8000pb.... Autant dire qu'en utilisant la formule mathématique classique pour le calcul j'obtenais des quantités d'insert à utiliser ultra faibles...
J'ai donc fait 2 tests un peu" au pif" je dois l'avouer: 100 ng de plasmide pour 100ng d'insert et 100ng de plasmide pour 50 ng d'insert. La seconde combinaison à fonctionné.

A quelle température faites vous votre ligation?
Il est déconseillé de la faire de façon statique (par exemple en utilisant un appareil de PCR) en dessous de 20°C car l'agitation moléculaire est insuffisante pour une activité enzymatique correcte.... Pour ma part, je fais ma ligation ON à 18°C dans un bain marie.

Aussi, je n'utilise les Top10 que pour des transformations courantes... Pour le clonage je préfère utiliser des cellules ultra compétantes (des XL10 gold par exemple... ).

En espérant avoir pu un petit peu répondre à vos questions, bonne journée!

PS: Concernant les quantités d'ADN dosées après purification, cela ne me choque pas. J'ai des quantités légèrement supérieures certes, mais du même ordre.

[invite2475de1a]

Patience, petit scarabée

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Ne soyez pas défaitiste

Bien reçu je ferais preuve de patience prochaienement hihi

[ananda]

Question bête, mais n'as-tu pas un encadrant direct auquel tu dois te référer en cas de question ? Un maître de stage ?

[invite2475de1a]

Pourquoi absolument ce plasmide? je ne le connais pas personnellement...

Bonsoir;

Je dois cloner dans ce plasmide car je vais l utiliser plutard pour transformer des levures par electroporation avec ce plamside PICZ recombinant.
c'est un YIP : yeast integrating plasmid , il a la capacité de s'intégrer dans le génome de la levure (Pichia pastoris).

En plus, il contient le promoteur des génes OX1 et OX2 qui codent pour les enzymes (alcool oxydase) qui permettent de metaboliser les methanol (source d'energie et de carbone essentiel à cette levure).

En gros, moi je fais le sous clonage dans top 10 pour amplifier le plamside recombinat PICZ-P30 pour pouvoir aprés l'introduire dans la levure pichia pastoris et le faire exprimer en induisant l'expression par l'ajout du methanol ds le milieu de culture.

ps : PICZ contient le géne de resistance pour la ZEOCIN.

J'espére que mes explications sont claires

[invite2475de1a]

Pour repondre à LXR,
Evidement je verifie aprés chaque étape la qualité de mon produit :

-control sur gel du produit PCR est excellent : j'ai fait une PCR en triplicate à partir du plamside PLIP6-p30 et je trouve 3 bande de taille 900pb qui corrependent à mon insert et qui sont intenses.
-control lors de la purif sur gel : positif
-controle aprés double digestion et purif sur gel du produit de digestion (sfi1 coupe partiellement) mais puisque c 'est un fragment lineaire je peux pas controler la quzlité de la digestion.
-j'ai fait ces controles aussi pour le plamside doublement digeré (j'ai purifié l'insert relargué aprés double digestion)
Pour ce qui est du faible dosage du produit PCR je pense que j 'ai un peu dilué car je suis parti de 20 microlitre d'ADN aprés double digestion et purif(pertes) j'ai dilué dans 75 microlitres.
de tte façon lors de la ligation j 'ai surtout utlilser l'insert issue du plamside doublement digéré.

[invite2475de1a]

Merci bp celyna pour ttes ses explications,
je voudrais ajouter que la taille de mon vecteur (PICZ) est de 3300pb alors que l'insert fait presque 900pb,ça me laisse penser que l'insert est peut etre un peu grand pour le vecteur...

En plus je vais essayer de suivre ton conseille et utiliser un bain marie à 18°C car moi j utilise le thermocycleur toute la nuit à 16°C.Si j'ai bien compris une bonne agitation lors de lincubation aide la reaction enzymatique.

Tu dis que tu as essayé la ligation avec 100ng de vecteur et 50 ng d'insert. il faut tjs suivre la regle mathematique ou bien faire de l'a peu prés?

je voulais aussi noter que j ai une faible quantité d'insert lors du dosage car mon enzyme sfi1 coupe trés paritellement et c'est celle que j utilise en premeirà cause de son mix qui est le moins concentré et donc ce qui explique les pertes aprés digestion et purif.

Merci encore pour l'aide et pour le shéma expliquatif du fonctionnement de la ligase.

[invite2475de1a]

Question bête, mais n'as-tu pas un encadrant direct auquel tu dois te référer en cas de question ? Un maître de stage ?

Trés bonne question

Au fait j'en ai un comme tout le monde. Mais moi j fais de la recherche et je prefére faire des efforts, me renseigner chercher moi méme de l'aide et trouver moi méme des solutions à le lui communiquer. comme ça je me sens plus impliquée et je ne fais pas que repondre aux ordres.

c'est bien ça le but de ce forum non? partager des experiences venir à l'aide les uns aux autres...

[invite2fb83916]

Tu dis que tu as essayé la ligation avec 100ng de vecteur et 50 ng d'insert. il faut tjs suivre la regle mathematique ou bien faire de l'a peu prés?

Mais de rien! Contente d'avoir pu aider si c'est le cas!!

Euh oui s'il y a une formule mathématique c'est qu'en général quand on l'utilise ça marche (en théorie!!).
Par contre dans mon cas ou déjà j'avais un tout petit insert par rapport à mon fragment, et qu'il fallait que je mette 100 ng de plasmide pour 8 ng d'insert si je me souviens bien... Je me suis dite que jamais ça marcherait! donc voilà, à chaque situation sa réponse!

Bonne chance pour le clonage!!

[LXR]

D'après ce que tu dis tu purifies ton ADN par extraction sur gel? Pour l'avoir aussi utilisé, la perte du matériel est énorme. Il vaut mieux purifier avec un kit de purification comme le PCR extraction kit (Qiagen) où la purif se fait directement sur ton produit de PCR, sans passer par un gel. Et le rendement est bien meilleur, beaucoup moins de perte.

[invite2475de1a]

Ah daccord merci LXR pour la precision, car jusque la j effectue la purif sur gel par un kit dont je retiens pas le nom.
j essayerais dorenavant de faire le purif directement sur colonne sans passer par le gel.
En revanche je tiens a preciser que j purifie l'ADN à partir du gel justement pour avoir la bande d interet comme par exemple l'insert relargué aprés double digestion et qui ne peut etre detecté qu'a partir du gel d agarose.

[invite1260514a]

Merci pour ces précisions, je comprends maintenant...
Concernant le clonage : Je soupçonnerai la ligation mais as-tu essayé une autre ligase (est-elle vieille?) car je te conseille une super t4 Ligase : chez Takara 5 min à 25°c ou 30 min à 16°c, elle marche très bien!!
concernant les bactéries, les Top 10 sont très bien, je clone toujours en utilisant ces bactéries.
Concernant la purification de l'ADN, je purifie tout le temps à partir d'une extraction sur gel et ça ne pose pas de problèmes (en utilisant le kit macherey), cependant tu peux passer ton agarose fondue et produit de PCR 2 fois sur la même colonne c'est à dire que tu reprends ce qui est passé et tu le repasses, tu auras d'avantage d'ADN.
Quel est ton protocole de transformation?

[invite2475de1a]

Bonsoir beberp35
Pour commencer, je pense pas qu'il sagit de la ligase car a chaque ligation jeffectue un controle ligase : j'utilise le vecteur simplement digéré auquel j 'ajoute la ligase pour controler la qualité de la ligase car le plasmide simplement digéré se ferme facilement avec la ligase et si aprés transformation je trouve des colonie qui poussent sur le milieu additionné d antibiotique c'est que la ligase est OK et c'est mon cas.
Alors aujourd hui on a parlé au labo des eventuels probleme qui entrave mon clonage et on ma proposé d utiliser une autre souche de Ecoli (JM109) qui se préte facilement selon eux au clonage.
J'ai refais hd la ligation en diluant un peu plus le milieu reactionnel et en augmentant un peu la quantité de ligase et j 'ai suivi le conseil de celyena en incubant dans un bain marie au lieu d'in thermocycleur et demain je ferais la transformation dans deux souches : top 10 et JM109.
Alors pour le protocole de la transoformation :
-J'ai lancer hd une preculture des deux souches
-demain je dilue au 1/100 et je laisse encore pousser jusqu'a DO de 0.4 ou 0.6
-incubation 30 min dans la glace
-centrifuger
-recuprer culot bacterien auquel j 'ajoute le TSS additionné de DMSO.
-Incubation dans la glace
-une fois les cellules sont competentes avec ce protocole je procéde à la transfo avec 200ul de bacterie compétente et 10 ul de pdt de ligation.
-choc thermique (30min glace /2 min 42°c/5 min glace)
-Additionné le milieu nutritif SOC et incuber pendant 1h a 37°C
-etalement sur boite additionné de zeocin dans mon cas.
Voila c 'est à peu prés ça le protocole de transformation.

[invite1260514a]

ok pour la ligase
Pour le protocole de transformation, 2 min à 42°c c'est beaucoup je ne fais que 30 secondes... et je ne met que 2µl du produit de ligation mais je ne pense pas que ça soit ça mais bon pour les 2 min à 42°c par contre ça peut faire la différence sur ta transformation

[invite2475de1a]

bonsoir tout le monde ;
Mon clonage a encore echoué j'ai refais la ligation la denriére fois en diluant le milieu reactionnel et en augmentant la quantité de ligase, j'ai aussi opté pour l'incubation en bain marie. En plus, j'ai transformé deux bactérie pour verifier la compétence (top 10 et JM109) avec ça j'ai effectué la ligation avec plusieurs rapport insert / vecteur,j'ai vraiement tt essayé mais rien!!!!!!!!!!!!

tout le monde au labo ne comprend pas pourquoi ça coince comme ça
et on me propose de reprendre le tout avec un autre plasmide (PET 22B+) au lieu du PLIP6 pour recupérer l insert. et mon je ne vois pas trop l interet

Vous avez une idée sur PET22B+? je vais couper avec ECOR1 et XHO1 et ce sont deux enzymes qui coupent partiellement. c'est vraiement pas gagné....

Entre nous, j 'ai decidé tout de méme de continuer à travailler avec mes anciens produit hihi vivement que ça marrrrrrrrrrrche.

[invite2fb83916]

Egalement je transforme 30 secondes à 42°C, jamais plus de 45 secondes.

[invite2475de1a]

Egalement je transforme 30 secondes à 42°C, jamais plus de 45 secondes.

Mon clonage ne marche tjs pas, pour la transformation est ce le choc thermique à 42°C pendant 2 minutes peut inhiber la transformation ou bien cela na pas vraiment d importance???

[Yoyo]

Mon clonage ne marche tjs pas, pour la transformation est ce le choc thermique à 42°C pendant 2 minutes peut inhiber la transformation ou bien cela na pas vraiment d importance???

c'est juste que 2min a 42°C tu dois tuer une bonne quantité de tes bactéries. En ce qui me concerne ca a toujours ete 30sec a 42!

Si vraiment ca ne marche pas ton insert peut etre toxique, en tout cas 900pt dans un plasmide de 3,3kb c'est surement pas trop grand! donc le probleme ne viens pas de la.
Comme LXR je soupçonnerai que tu perds beaucoup d'insert apres ta purif. Or en BM plus tu as de materiel mieux ca marche.
Pourquoi purifies tu ton insert sur gel? ta PCR te donne plusieurs bandes? si ce n'est pas le cas (que tu as une bande unique) alors purifie juste sur une colonne.

Yoyo

[invite2475de1a]

Merci pour la reponse YoYo;

En fait pour la purif sur gel on m'a conseillé jusque la de faire la purif sur gel comme quoi l'ADN matrice sera aussi retenu sur gel alors que moi je le dilue au 1/10 avant de procéder a la reaction PCR et sur le gel de control je n'ai qu'une seule bande. Dorenavant je ferais la purif sur colonne pour purifier le produit PCR.
Ceci dit jusque la je compte pas trop sur le clonage avec l insert issue de la digestion du produit PCR parceque j ai des constructions deja faites par des etudiants qui ont passé jadis par le labo à savoir le plasmide PLIP6-P30 et le PET22b(+)- P30 et donc je recupére mon gene d interet qui code pour la P30 à partir de ces constructions.L'avantage par rapport au produit PCR est que la on peut controler la digestion (passage du circulaire au lineaire) chose pas possible avec le produit PCR , donc jusque la j ai cloner avec l'INSERT issue de la double digestion à patir du plasmide,la derniére fois le dosage de cet insert purifié est de 10.2ng/ul.
Vu l'echec du clonage à chaque fois, demain je procédérais à une ligation avec l'insert issue d'un produit PCR doublement digéré ECOR1 et XHO1 mais je peux pas le quantifier j aurais à faire ça au pif....

Je vais suivre vos conseils et faire la transfo a 30seconces mais j sais pas si 2 min à 42°C tue vraiment les bactéries car le controle compétence (cellules compétente plus 1 ul de plasmide sauvage) est impeccable...

Par ailleurs j aimerais savoir si on peut controler le produit de ligation sur gel avant de transformer pour comprendre et pouvoir trancher entre probleme de ligation ou probleme de transformation et est ce que c'est normal qu'un clonage soit aussi dure à realiser ça fait qd mm 2 mois hihihi

Merci à tous pour votre aide

[invite2475de1a]

[QUOTE=

En fait pour la purif sur gel on m'a conseillé jusque la de faire la purif sur gel comme quoi l'ADN matrice sera aussi retenu sur gel alors que moi je le dilue au 1/10 [/QUOTE]

Je me corrige je voulais dire "comme quoi l'ADN matrice sera retenu sur colonne"