Ligation

[inviteb4ac2cb1]

Bonjour !

Alors j'ai un compte-rendu à rendre sur l'analyse du gène de résistance à la tétracycline. L'étude se fait sur une souche résistante (TetC) et deux souches mutantes (M1 et M2) qui ont perdu cette résistance. L'objectif est de trouver pourquoi : nature de la mutation et position.

Dans la 1ere partie du TP, on a amplifié par PCR les gènes TetC, M1, M2; on a réalisé une électrophorèse, qui a permis de quantifier les produits et aussi de déduire que M1 avait subit un substitution et M2 une délétion.
Ensuite chaque produits de PCR ont été clonés dans un plasmide ouvert par EcoRV au cours d'une ligation.
Les plasmides recombinants ont été introduits dans des bactéries par transformation.
Les colonies de bactéries issues de cette dernière ont été isolées sur gélose.
Les colonies de bactéries contenant un plasmide recombinant se différencient des autres colonies bleues par leur couleur blanche.
Et enfin après purification de l'ADN plasmidique des bactéries, on a réalisé son analyse par digestion enzymatique.

J'ai compris l'essentiel du TP je pense, mais je bloque encore sur certaines choses...
Lors de la ligation, on a dû préparer 5 tubes pTetC, pM1, pM2, et 2 tubes témoins. Ils contiennent tous le vecteur digéré. Ce que je n'arrive pas à résoudre, c'est pourquoi il y a deux témoins et l'information qu'ils apportent, sachant que T1 ne contient pas de ligase, et T2 en contient... Le prof m'a fait comprendre que c'était une question important à résoudre pour la suite, mais je sèche un peu ! Donc en fait pour le moment j'aimerai savoir le rôle des témoins, pourquoi 2 témoins, la différence ? Témoin de ligation etc....

Bon merci d'avance pour ceux qui pourront m'aider ^^ !
Et j'attends avec impatience des réponses
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[Zellus]

Bonjour,

T1 est un contrôle qui permet de voir combien tu obtiens de clones avec ta simple digestion de plasmides. Si tu as des colonies c'est que tu as encore des plasmides qui n'ont pas été digérés pendant cette étape.
T2 permet de voir l'efficacité de la ligation. Tu vas recirculariser tous les plasmides digérés et donc sur ta boîte tu auras plus de colonies que dans T1.
Mais le problème c'est que tu devrais avoir environ autant de colonies que dans les conditions pTetC, pM1 et pM2. Et donc sur ces boîtes parmi tes clones tu vas en avoir plein qui ne possèdent que le plasmide sans insert.
En général, on déphosphoryle le plasmide après la digestion et on fait un contrôle de ligation avec ligase et sans insert (mais vous n'avez pas déphosphorylé pendant ton TP si ?). Comme ça ça te montre combien tu as de plasmides qui se recircularisent (et donc mal déphosphorylés) et tu en as beaucoup moins sur boîte qu'en T2. Et donc tu auras beaucoup moins de faux positifs sur les boîtes pTetC, pM1, pM2 où tu as ton insert.
Voilà je sais pas trop si je suis clair parce que je suis un peu fatigué là lol.

[inviteb4ac2cb1]

Tout d'abord merci de m'avoir répondu !

Hum pour ce que tu as pour T1 :
"Si tu as des colonies c'est que tu as encore des plasmides qui n'ont pas été digérés pendant cette étape."
ça ne me semble pas logique, car le plasmide ouvert ou non, s'il est présent dans la bactérie, permet de résister à l'ampicilline et permet donc aux colonies de se développer dans la boîte. Le gène de résistance de l'ampicilline n'étant pas localisé dans la zone de coupure. J'avais posé la question à mon prof si le gène sur le plasmide s'exprimait quelle que soit la forme sous laquelle se trouvait le plasmide.
Donc pour moi T1 est un témoin pour montrer le nombre de colonies ayant intégré un plasmide.. Témoin de transformation c'est ça ?
Du coup...T2 contenant de la ligase, serait le témoin de ligation oui... Mais je ne vois pas en quoi il montre l'efficacité de la ligation, vu qu'avec ou sans ligase des colonies poussent ! Tant que le plasmide est dans la bactérie en gros.......

Sinon pour le nombre de colonies j'ai obtenu ça :
T1 : 13bleues 0blanches ; T2 : 33bleues 0blanches ; pTetC : 90 bleues 4blanches ; pM1 : 27 bleues ?blanches ; pM2 : 84bleues ?blanches
On avait beaucoup de satellites autour des colonies bleues, donc pour M1 et M2 on était pas sûr si c'était que des satellites ou s'il y a avait des colo blanches, même si on doit trouver des colonies blanches par logiques.
Mais à mon avis vu les résultats super divers qu'on a eu, on ne peut pas trop les prendre en compte. Beaucoup dans la classe pensaient qu'on devait trouvé des colo blanches que dans pTetC, alors que non, on s'attend à en trouver là où il y a les inserts.

Euhhh pour la déphosphorylation j'ai pas tout compris ??
Notre plasmide a été digéré par EcoRV, qui génère des extrémités franches. Ces extrémités ne sont pas compatibles avec les extrémités des produits de PCR. Car la Taq pol rajoute un nucléotide (souvent dATP) sur 3'OH des fragments néosynthétisés. Donc pour que ce soit compatible les extrémités du vecteur doivent porter dTTP en 3'OH. L'extension d'un dTTP en 3'OH du plasmide linéarisé par EcoRV est réalisé grâce à la Taq pol.
Je ne sais pas si cette information est importante pour l'explication des 2 témoins ?

[Flyingbike]

ça ne me semble pas logique, car le plasmide ouvert ou non, s'il est présent dans la bactérie, permet de résister à l'ampicilline et permet donc aux colonies de se développer dans la boîte

justement non, et c'est bien l'intérêt du témoin !

[A voir en vidéo sur Futura]

[Flyingbike]

L'extension d'un dTTP en 3'OH du plasmide linéarisé par EcoRV est réalisé grâce à la Taq pol.

tu es sur ? a ma connaissance, la taq pol fait un A overhang en 3' uniquement...

[inviteb4ac2cb1]

D'accord...
Bon je ne comprends pas alors pourquoi mon prof m'a dit que si le gène était là et que le plasmide soit ouvert ou non,il pouvait s'exprimer quand même! Car à la base j'étais partie justement dans l'hypothèse que si les plasmides n'étaient pas refermés et bien la bactérie ne pouvait pas pousser sur un milieu avec de l'ampicilline car il n'y avait plus la résistance, d'où l'utilité donc de ce témoin... Ralala, ça m'a embrouillé du coup !!!

Sinon pour la Tap DNA polymérase, c'est ce qui est marqué dans mon poly.
"L'extension d'un dTTp en 3'OH du pBS linéarisé par EcoRV a été réalisé grâce à la Taq DNA Polymérase. Le vecteur ainsi obtenu est appelé pBS(EcoRV+T). Il vous est fourni."