Salut a tous,
Mes questions sont les suivantes,
pourqoi on utilise NaAc et lethanol pour precipiter le dna, je veut dire pourqoi ensemble est ce que l ethanol seul ne suffit pas,
quelles sont les manieres pour eviter que le plasmide lineair ne se recirculariser pas son que l insert est dedans.
merci davance,
Bonjour,
Je pense que tu as utilisé un protocole qui te permet de séparer l'ADNplasmidique de l'ADNgénomique, non ?
Tu as du enlever les ARN de ton lysat cellulaire en premier lieu (par des RNAses).
Ensuite, tu as du ajouté un agent dénaturant à pH très basique (NaOH par exemple) afin de dénaturer l'ensemble des ADN de ton échantillon.
Puis tu as du ajouté un agent renaturant à pH très acide (NaAc par exemple) qui permet aux ADN de se renaturer rapidement. Cependant, l'ADNplasmidique se renature beaucoup plus rapidement car il est plus petit que l'ADNgénomique. Ainsi, l'ADNgénomique très gros va précipiter et l'ADNplasmique va rester en suspension dans ta solution.
Tu récupères ainsi ton ADNplasmidique en prélevant le surnageant et tu le laves à l'éthanol 100 puis à l'éthanol 70 afin d'enlever les sels autour de ton ADNplasmidique.
Ensuite, tu as du digérer ton plasmide afin de l'ouvrir au niveau de son site polylinker (plasmide linéarisé), tu as digéré ton insert également, et tu as mélangé les deux afin d'obtenir ton plasmide avec son insert.
Comment savoir alors que ton plasmide ne s'est pas circularisé entre temps?
En théorie, il est très probable qu'il se recircularise sur lui-même.
En pratique, on travaille rapidement et à froid entre chaque étape (afin d'éviter que le plasmide reste trop "seul" en solution et se circularise).
Ensuite, lorsqu'on fait le mélange de ligation, on va rajouter 2 fois plus d'insert que de vecteur afin de favoriser le sens: vecteur + insert => vecteur-insert au détriment de la réaction: vecteur linéaire => vecteur circulaire.
Enfin, tu auras toujours un "bruit de fond" lié à la recircularisation de ton vecteur, tu dois le déterminer pour pouvoir évaluer l'efficacité de ta ligation, pour cela, tu déposes ton échantillon après ligation sur un gel d'agarose, et tu fais une analyse quantitative grossière grâce à ton marqueur d'ADN.
Enfin, n'oublies pas que tu as dois toujours faire des étapes de vérifications entre chaque étape de ton protocole afin d'éviter de progresser dans le protocole si l'une des étapes n'a pas marché.
Par exemple, lorsque tu fais ta digestion, il est conseillé de faire des témoins négatifs (sans enzymes de restrictions), des témoins positifs (lors d'une double digestion, tu vas faire deux témoins de simple digestion), puis tu vas faire migrer le tout (ton produit de digestion, tes trois témoins) sur des gels d'agarose.
Tu dois également réaliser des témoins lors de ta ligation: vecteur seul sans ligase (=> permet de déterminer si ton vecteur se circularise beaucoup lorsqu'il est seul), vecteur seul avec ligase (=> idem mais sous l'action de la ligase).
Cordialement
Merci pour la reponse,
jai pense a autre chose pour eviter le recircularisation par ex. ajouter phosphatase 5´, ddNTP ou bien un groupe methyle.
est ce que c est raisonnable=
cordialement
Ajouter de la phosphatase alkaline pour empêcher le vecteur de se recirculariser est couramment employé en biologie moléculaire.
Ajouter un ddNTP aux extrémités avec une terminal transférase (je ne vois que cette activité enzymatique pour effectuer cette modification) conduirait à une impossibilité du vecteur à se recirculariser de façon irréversible. Il restera définitivement linéaire à moins d'ajouter une exonucléase peut-être, mais de toute façon je n'ai jamais entendu parler de l'utilisation de cette méthode pour empêcher un vecteur de se recirculariser, ni de son utilité. Dans le cadre d'un clonage/sous-clonage, cette méthode est inutile.
Un groupe méthyle : je ne vois pas ce que tu veux dire (où l'ajouter?).
Classiquement, pour favoriser l'insertion de l'insert dans le vecteur :
- Soit on déphosphoryle le vecteur
- Soit on clive le vecteur avec deux enzymes de restriction différentes qui génèrent des bouts collants incompatibles. L'insert est clivé avec les même enzymes. Cette méthode a l'avantage d'empêcher la recircularisation du vecteur et favoriser une insertion orientée de l'insert dans le vecteur.
Greg
Bonjour Grec,
Merci pour l explication ca va m aider pour mon rapport de tp.
cordialement.
