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Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

  1. Arco

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Messages
    6

    Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Bonsoir à tous !

    Tout d'abord, merci d'avoir pris la peine de cliquer sur ce post

    Voilà, je suis en pleine rédaction de mon travail de fin d'étude qui portait sur l'utilisation de la RAPD-PCR en tant que méthode de différenciation d'espèces fongiques. Il a donc évidemment fallu passer par la réalisation d'une électrophorèse sur gel d'agarose.

    Le souci que je rencontre est que personne dans le labo ne sait quelle est la composition exacte du tampon de charge des échantillons pour le gel. (j'ai utilisé un aliquot laissé par la dernière personne ayant fait de la génétique au labo mais qui a depuis quitté les lieux)

    Auriez-vous une idée et de la composition ainsi que des quantités des réactifs pour en faire mettons 10 mL?

    En farfouillant un peu sur le forum, je suis tombé sur ce post très intéressant :
    Extraction, purification et analyse d'ARN (Nanodrop et bioanalyser)
    ou Flyingbike cite : "tris, bleu(s), glycerol ou sucrose, eventuellement EDTA"
    Pour le Tris, duquel s'agit-il et à quel pH ?
    De quel bleu s'agirait-il ?
    Et à quoi servent ces différents composants pratiquement ?
    Le Tris, je présume qu'il a pour rôle de stabiliser l'ADN, le colorant... de colorer le front de migration ^^, mais le glycérol et l'EDTA ?

    Voilà, votre aide me serait vraiment très précieuse.

    Merci d'avance !

    -----

     


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  2. gorben

    Date d'inscription
    mars 2005
    Localisation
    Bethesda, USA
    Âge
    38
    Messages
    1 109

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Salut,

    Tu vas avoir autant de recette que de chercheur

    Ce qui est important c'est le dye (bleu de bromophenol generalement) pour suivre la migration et le sucrose/ficoll/glycerol qui permettent a tes echantillons d'aller au fond du puit lorsque que tu deposes.

    Le reste ca n'a pas/peu d'importance et peu etre omit. Si tu veux plus d'infos, essaie "agarose loading buffer" sur google.

    A+
     

  3. LXR

    Date d'inscription
    avril 2007
    Localisation
    Genève (CH)
    Messages
    3 926

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Pour le tris, il a pour rôle de tamponner le tampon de charge, et il n'y a qu'un seul tris. On ajoute souvent HCl pour dire qu'on a descendu le pH avec de l'HCl car le tris est basique, donc tris-HCl. Tris-NaOH c'est lorsqu'on a augmenté le pH avec du NaOH pour faire une solution encore plus basique. Pour un tampon de charge, c'est Tris-HCl.

    Le glycérol, Gorben a expliqué à quoi il servait, pour ce qui est de l'EDTA il a un rôle de stabilisation de l'ADN en empêchant sa dégradation par des DNase qui sont dépendantes de cofacteurs cationiques divalents (l'EDTA est un chélateur de cations divalents (Mg2+), ce qui veut dire qu'il les capture). Peut-être l'EDTA a-t-il un autre rôle que je ne connais pas...
     

  4. Arco

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Messages
    6

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Merci beaucoup pour ces précieuses informations !!!
    M'est d'avis que la recette devait approcher quelque chose comme :
    * 25mg bromophenol blue
    * 4g sucrose
    * H2O to 10mL
    Cependant, cela devait être du glycérol et non pas du sucrose dans mon cas, donc environ 4 mL j'aurais envie de dire ^^

    J'en profite accessoirement de vous demander si vous ne connaissez pas un site pour retrouver la séquence d'une amorce à partir du nom utilisé dans un article ? Mon maître de stage est injoignable pour le moment et a embarqué tout le matériel car il a changé d'emploi ^^
    Je suppose que les noms ne reflètent pas véritablement une séquence, mais je me trompe peut-être !

    Encore merci de partager votre sagesse
     

  5. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Viroflay
    Âge
    32
    Messages
    5 118

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    de quels noms parles-tu ?

    pour le glycérol, 4mL dans 10 ca fait beaucoup. Fais du 25%, en l'utilisant a 4X ca fera 6,25% final.
     


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  6. Arco

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Messages
    6

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Bien reçu merci

    Un nom du genre "P71" et "NS3" en l'occurrence.
     

  7. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Viroflay
    Âge
    32
    Messages
    5 118

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    c'est le nom des gènes qu'elles amplifient peut être, non ?
     

  8. Flyingbike

    Date d'inscription
    septembre 2009
    Localisation
    Viroflay
    Âge
    32
    Messages
    5 118

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Dans ce cas, le nom d'un gène ne te donnera pas les amorces qui ont été utilisées. Il faut soit regarder si elles sont dans la publication (des fois en supplemental data) soit les demander aux auteurs, soit les designer toi-même.
     

  9. Arco

    Date d'inscription
    décembre 2009
    Messages
    6

    Re : Tampon de charge pour électrophorèse sur gel d'agarose

    Citation Envoyé par Flyingbike Voir le message
    c'est le nom des gènes qu'elles amplifient peut être, non ?
    J'en doute étant donné qu'il s'agit de RAPD PCR ca amplifie au petit bonheur la chance.

    Merci beaucoup pour l'aide précieuse, en tout cas ! Bonne journée à vous !
     


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