Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 9 sur 9

plasmide-clonage




  1. #1
    lagwagon

    plasmide-clonage

    Bonsoir , j'ai une petite question en ce qui concerne l'insertion d'un géne dans un plasmide.
    aprés avoir rendu les bactéries compétantes et les avoir coupé avec des enzymes de restriction , on peut faire rentrer la molécule d'adn dans les bactéries , ensuite il faut repérer les bactéries ayant reçu ce géne.
    est ce que pour cela on met sur ce géne (appellé insert) un géne de selection , responsable de la resistance a un antibiotique?
    je pense que c'est cela , mais ensuite on me dis qu'il faut trouver un moyen pour trouver les bactéries avec vecteur vide (n'ayant pas reçu ce géne) , on utilise alors le systéme avec la béta galactosidase ( je n'explique pas plus ) pour rendre ces bactéries bleu.
    mais les bactéries avec vecteur vide ne devraient elles pas mourrir?

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    Morphine

    Re : plasmide-clonage

    Bonsoir,

    Tous gène de résistance à un antibiotique (Ampiciline par exemple), te sert en fait a sélectionner tes bactéries ayant le plasmide.

    En les faisant pousser sur milieu complet + ampiciline, seul les bactéries avec le gène de résistance contenu dans le plasmide survivront.

    Ton gène ou fragment d'ADN que tu désires cloner est inséré dans le plasmide grace à un polylinker qui coupe le gène de la bétagalactosidase (bgz).

    Ainsi, l'insertion d'un fragment d'ADN au milieu de ta séquence codante de la bgz empêche son expression.
    Sur milieu X-gal, un substrat de la bgz, tu pourras différencié les bactéries ayant un insert de celle n'en n'ayant pas.

    Les plasmides vides ont une bgz active et sur milieu X-gal seront colorés.
    Les plasmides ayant un insert dans la bgz resteront blanche.

    Voila en gros le principe.
    J'espère ne pas avoir dis de bétise....

  4. #3
    mantOs

    Re : plasmide-clonage

    Citation Envoyé par Morphine Voir le message
    Les plasmides vides ont une bgz active et sur milieu X-gal seront colorés.
    ... en bleu ( petite précision )

    Le reste est bon

    Cordialement
    Paul
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.


  5. #4
    Yoyo

    Re : plasmide-clonage

    salut

    Le principe est bon, sauf que le gene de la Bgal etant tres grand (3Kb) on utilise plutot le phenomene d'alpha complementation pour faire cette selection blanc/bleu.
    en fait le plasmide porte un tout petit fragment (N-terminal) de la Bgal. Le reste de l'enzyme est codé par le chromosome. uand les deux morceaux sont exprimés l'enzyme est fonctionnelle et ca donne du bleu, quand le petit n'est pas exprimé alor l'enzyme n'est pas fonctionnelle et ca donne du blanc (du moins en theorie)

    yoyo

  6. #5
    lagwagon

    Re : plasmide-clonage

    en fait je m'étais un peu brouillé.
    est ce que ce qui suit est juste?
    dans le plasmide il ya un géne de resistance a un antibiotique , dans ce plasmide on peut inserer un fragment d'adn a cloner.
    on met ensuite le plasmide dans des bactéries qui n'ont pas justement de géne re resistance a l'antibiotique , ce qui permet de localiser celle qui ont reçu le plasmide?
    merci d'avance

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Elendilmir

    Re : plasmide-clonage

    C'est ça, mais attention à un détail.
    Que la bactérie "pousse" veut dire qu'elle a reçu le plasmide (contenant le gène de résistance à l'antibiotique), pas forcément le plasmide avec le fragment d'ADN qui t'interesse dedans. Il faut alors vérifier.

    En général (hors système Bleu-blanc de la B-Gal), on extrait l'ADN des colonies ayant poussé (miniprep : on pique une colonie, on la fait pousser en culture une nuit dans un milieu liquide contenant l'antibiotique en question, puis on la casse et on purifie son ADN) et on coupe l'ADN avec des enzymes de restriction pour déterminer quelle colonie possède le fragment d'intérêt (on dit alors que la colonie est un clone "positif") et l'ADN de cette colonie est alors amplifié par Midipreps pour être utilisé .
    Qui s'assied au fond d'un puits pour contempler le ciel le trouvera petit.

  9. #7
    Didie13

    Re : plasmide-clonage

    Bonjour à tous,

    Alors voilà j'aimerai connaître plus en détails (enfin de manière simple quand même, je ne suis qu'en première année licence Bio) le principe de la séléction blanc/bleu?

    Merci d'avance!

  10. Publicité
  11. #8
    Yoyo

    Re : plasmide-clonage

    Citation Envoyé par Didie13 Voir le message
    Bonjour à tous,

    Alors voilà j'aimerai connaître plus en détails (enfin de manière simple quand même, je ne suis qu'en première année licence Bio) le principe de la séléction blanc/bleu?

    Merci d'avance!
    salut

    le principe est expliqué dans le message 2 avec les nuances que j'y ait apporté dans mon précédent message.

    yoyo

  12. #9
    Didie13

    Re : plasmide-clonage

    ah oui merci désolé je n'avais pas bien lu

    Ok ok! Merci!

Discussions similaires

  1. [Génétique] Plasmide
    Par MELISAB dans le forum Biologie
    Réponses: 3
    Dernier message: 19/12/2007, 22h36
  2. [Biologie Moléculaire] nomenclature plasmide
    Par koko19 dans le forum Biologie
    Réponses: 1
    Dernier message: 13/10/2007, 23h50
  3. Clonage clonage clonage est ce c’est vraie ou non ???
    Par lovelysarah dans le forum Biologie
    Réponses: 1
    Dernier message: 12/04/2007, 19h35
  4. Premier clonage de cellules souches : la course au clonage humain s'accélère
    Par RSSBot dans le forum Commentez les actus, dossiers et définitions
    Réponses: 0
    Dernier message: 23/05/2005, 10h13
  5. plasmide
    Par mag dans le forum Biologie
    Réponses: 5
    Dernier message: 20/04/2005, 15h10