plasmide-clonage

[invite21d35e82]

Bonsoir , j'ai une petite question en ce qui concerne l'insertion d'un géne dans un plasmide.
aprés avoir rendu les bactéries compétantes et les avoir coupé avec des enzymes de restriction , on peut faire rentrer la molécule d'adn dans les bactéries , ensuite il faut repérer les bactéries ayant reçu ce géne.
est ce que pour cela on met sur ce géne (appellé insert) un géne de selection , responsable de la resistance a un antibiotique?
je pense que c'est cela , mais ensuite on me dis qu'il faut trouver un moyen pour trouver les bactéries avec vecteur vide (n'ayant pas reçu ce géne) , on utilise alors le systéme avec la béta galactosidase ( je n'explique pas plus ) pour rendre ces bactéries bleu.
mais les bactéries avec vecteur vide ne devraient elles pas mourrir?
-----

[invitead282ff2]

Bonsoir,

Tous gène de résistance à un antibiotique (Ampiciline par exemple), te sert en fait a sélectionner tes bactéries ayant le plasmide.

En les faisant pousser sur milieu complet + ampiciline, seul les bactéries avec le gène de résistance contenu dans le plasmide survivront.

Ton gène ou fragment d'ADN que tu désires cloner est inséré dans le plasmide grace à un polylinker qui coupe le gène de la bétagalactosidase (bgz).

Ainsi, l'insertion d'un fragment d'ADN au milieu de ta séquence codante de la bgz empêche son expression.
Sur milieu X-gal, un substrat de la bgz, tu pourras différencié les bactéries ayant un insert de celle n'en n'ayant pas.

Les plasmides vides ont une bgz active et sur milieu X-gal seront colorés.
Les plasmides ayant un insert dans la bgz resteront blanche.

Voila en gros le principe.
J'espère ne pas avoir dis de bétise....

[mantOs]

Les plasmides vides ont une bgz active et sur milieu X-gal seront colorés.

... en bleu ( petite précision )

Le reste est bon

Cordialement
Paul

[Yoyo]

salut

Le principe est bon, sauf que le gene de la Bgal etant tres grand (3Kb) on utilise plutot le phenomene d'alpha complementation pour faire cette selection blanc/bleu.
en fait le plasmide porte un tout petit fragment (N-terminal) de la Bgal. Le reste de l'enzyme est codé par le chromosome. uand les deux morceaux sont exprimés l'enzyme est fonctionnelle et ca donne du bleu, quand le petit n'est pas exprimé alor l'enzyme n'est pas fonctionnelle et ca donne du blanc (du moins en theorie)

yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite21d35e82]

en fait je m'étais un peu brouillé.
est ce que ce qui suit est juste?
dans le plasmide il ya un géne de resistance a un antibiotique , dans ce plasmide on peut inserer un fragment d'adn a cloner.
on met ensuite le plasmide dans des bactéries qui n'ont pas justement de géne re resistance a l'antibiotique , ce qui permet de localiser celle qui ont reçu le plasmide?
merci d'avance

[Elendilmir]

C'est ça, mais attention à un détail.
Que la bactérie "pousse" veut dire qu'elle a reçu le plasmide (contenant le gène de résistance à l'antibiotique), pas forcément le plasmide avec le fragment d'ADN qui t'interesse dedans. Il faut alors vérifier.

En général (hors système Bleu-blanc de la B-Gal), on extrait l'ADN des colonies ayant poussé (miniprep : on pique une colonie, on la fait pousser en culture une nuit dans un milieu liquide contenant l'antibiotique en question, puis on la casse et on purifie son ADN) et on coupe l'ADN avec des enzymes de restriction pour déterminer quelle colonie possède le fragment d'intérêt (on dit alors que la colonie est un clone "positif") et l'ADN de cette colonie est alors amplifié par Midipreps pour être utilisé .

[Didie13]

Bonjour à tous,

Alors voilà j'aimerai connaître plus en détails (enfin de manière simple quand même, je ne suis qu'en première année licence Bio) le principe de la séléction blanc/bleu?

Merci d'avance!

[Yoyo]

Bonjour à tous,

Alors voilà j'aimerai connaître plus en détails (enfin de manière simple quand même, je ne suis qu'en première année licence Bio) le principe de la séléction blanc/bleu?

Merci d'avance!

salut

le principe est expliqué dans le message 2 avec les nuances que j'y ait apporté dans mon précédent message.

yoyo

[Didie13]

ah oui merci désolé je n'avais pas bien lu

Ok ok! Merci!