Culture cellulaire en 96 puits

[invite72dd760d]

Bonjour a toutes et a tous !

Je viens de changer de sujet de recherche et je fais mes premiers pas en culture cellulaire. Je me demandais s'il y avait quelqu'un par ici qui pourrait me guider dans mes premiers pas ?!

Je travaille sur des cellules epitheliales et je dois faire des manips en plaques de 96 puits. J'ai deja du mal a faire des replicats corrects lorsque j'ensemmence les puits, mais avec un peu d'entrainement, ca devrait venir...

Non, ce qui m'inquiete le plus, ce sont les comptages au Bleu de Trypan : je mets 30 microlitres de trypsine par puits, puis autant de milieu de culture lorsque les cellules se sont decollees. Mais alors je suis trop diluee pour faire un comptage correct. J'ai fait une tentative de centrifugation pour concentrer les cellules, mais dans de si petits volumes, je me demande si cela est bien raisonnable ! Donc je me demande par exemple si je peux utiliser de la trypsine plus concentree pour etre des le debut dans un volume plus faible et ne pas avoir besoin de concentrer ?

Bon, voila, si qq'un a l'habitude de travailler en 96 puits et a la patience de me repondre, et bien je le felicite et le remercie d'avance !!!
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[invite61d76751]

Bonjour Pamandine,

J'ai déjà eu l'occasion de faire de la culture cellulaire, certes pas sur d'aussi petits volumes, mais chaque fois que je devais faire des comptages, je concentrais la trypsine pour n'avoir aucun souci en suite au niveau de la dilution du milieu cellulaire.

Voilà, j'espère que ça ira et bon courage pour la suite.

[invite715e605c]

oui l,utilisation de trypsin plus concentré ca aide, et arrêté la réaction avec une goutte de sérum pure, ca inhibe la trypin dans un petit volume

[inviteb1765f58]

N'oubliez pas que la tryspsine est un toxique pour les cellules! Je vous conseille tout de même de ne pas appliquer directement des concentrations trop fortes directement sur vos cellules au risque d'avoir une chute drastique de viabilité ainsi qu'une dédifférentiation de celles-ci!

[A voir en vidéo sur Futura]