Pureté de l'ADN / efficacité d'expression

[invite3fd44d4e]

Bonjour à tous,

d'abord mes excuses si, ma recherche dans les archives du forum s'étant avérée infructueuse, j'ai loupé la réponse à la question que je vais poser.

J'utilise un protocole de transfection par électroporation sur des cellules HEK293/COS-7, à l'aide d'ADN plasmidiques obtenus de maxi-preps. Le rapport A260/A280 est rarement de 1,8 (l'idéal), plus souvent autour de 1,6 - 1,7.

Certains d'entre vous ont ils déjà constaté que la pureté de l'ADN au départ pouvait affecter la capacité des cellules, ensuite, à exprimer *correctement* les protéines ? Je ne parle pas ici de taux de transfection, qui est bon, ce que m'indique la GFP co-transfectée par exemple.

Question subsidiaire : je n'ai aucune expérience avec le calcium phosphate (mais une assez importante avec les reactifs type lipofectamine/fugene); cette technique donne t elle de meilleurs résultats, en terme de santé des cellules par exemple, que l'électroporation ?

merci d'avance
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[invite5351d78c]

salut et bienvenue sur le forum ,

pour ce qui est de la pureté de ton ADN pour les transfections, si tu tourne autour de 1,6-1,7 c'est vraiment bien. Pour être honnête, moi j'avais une prép de plasmide qui tournait plutôt autour des 1,4-1,5 et mes transfections sur cellules marchaient très bien, y compris le taux d'expression de la protéine qui convenait pour mon type de manip. En plus comme toi c'était des Cos-7, les HEK293 j'ai jamais utilisé. Et c'est sûr que selon le type cellulaire on peut avoir de gros écarts d'efficacité de transfection.

Pour ce qui est de la technique au phosphate de calcium, elle est très efficace quand on la maitrise. Mais il faut un certain temps avant de la maitriser car la préparation d'un précipité optimal demande un savoir faire important car selon les variations de pH, de température, de salinité du milieu l'environnant, le précipité change et peu ne plus convenir pour la transfection. Sinon l'électroporation c'est bien pour les bactéries car c'est assez costaud une bactos! Mais sur les cellules il leur faut plus de temps pour récupérer.
Ma technique de prédilection c'est le jetPEI, c'est génial et les cellules aiment bien aussi car il y a très peu de toxicité, très peu d'étapes donc peu de mortalité. Je te la conseille fortement . Avec la lipofectamine, c'est l'une des meilleures méthodes (enfin d'après moi ).

A+

[invite3fd44d4e]

Hello,

Merci pour ta réponse

Pour ce qui est des techniques de transfection, j'ai un mauvais souvenir de la lipofectamine, que je trouvais très toxique, surtout pour les COS-7. A contrario, le Fugene6 est plus facile d'utilisation (transfection dans le milieu avec le sérum, aucune toxicité, taux de transfection remarquable). Dans le labo où je suis aujourd'hui, électroporation, nucléofection et phosphate de calcium dominent : je m'adapte !

Ma pureté est pas mal, mais je me posais juste cette question car je fais de la coexpression de protéines (récepteurs du glutamate) assez grosses et complexes et, mes résultats étant un peu disons étonnants, je cherchais une raison...

D'ailleurs, autre question : pour "re-purifier" l'ADN, le précipiter est il efficace depuis une miniprep ? Depuis une miniprep toujours, peut on envisager d'enchaîner sur une autre méthode de purification, comme le chlorure de Césium par exemple ?

merci

[Jean-Luc P]

Si tu transfecte des NMDAR penser à mettre de l'APV dans le milieu car le glutamate contenu dans le milieu rend le NMDAR toxique !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3fd44d4e]

Ouaip

merci
le milieu de culture contient de l'APV plutot concentré (500µM), donc l'excitotoxicité devrait pas poser trop de problèmes à ce stade..