[bio mol] pUC et LacZ

[zendub]

bonjour à vous,

pour ma part je viens de me rendre compte que la biologie moléculaire aura le pouvoir, ou non, de sauver ma 2em année de pharmacie !

Bref, je vais essayer de ne pas trop être feignants. j'ai consulté les liens proposé pour la bio mol et je n'ai pas vraiment trouvé ce qu'il me fallait !
Bref, j'ai des notes très flou concernant le vecteur pUC et le gène LacZ !

j'ai noté que "cela permettais la selection des bactéries en fonction du plasmide qu'elles synthétisent"
Bref vous n'avez pas les notes devant mes yeux et cela n'avancera à rien ...

Mais j'aimerai comprendre ce système de vecteur et surtout du gène LacZ ...

on intègre un fragment d'adn dans ce plasmide pUC. ensuite on l'introduit dans une bactérie et l'importance des sites de réplication du pUC va permettre un clonage important du fragment d'adn souhaité !
Mais que viens faire alors ce gène LacZ ? je sais qu'en présence de glucose celui-ci va permettre sa dégradation en créant les protéine necessaire ... mais je vois vraiment pas son interet ici !

quelqu'un pourrait-il m'éclairer ?

merci d'avance
-----

[invitece4c5732]

C'est très simple !

Sur le plasmide pUC, on a donc le gène LacZ. Quand on fait le clonage, on va faire en sorte que le gène d'intérêt s'intègre dans le plasmide AU MILIEU du gène LacZ.
De ce fait, le gène LacZ ne peut pas s'exprimer.

En présence de glucose, les bactéries aillant intégrer le plasmide pUC composé du gène LacZ+ du gène d'intérêt ne vont donner aucune coloration, tandis que celle qui ont intégré un plasmide non recombinant (sans le gène d'intérêt, donc avec un gène LacZ non interrompu) vont faire une coloration bleue.

C'est donc une technique permettant la sélection des bactéries recombinantes.

[zendub]

hum merci beaucoup pour cette réponse précise

[gorben]

Salut,

Juste quelques precisions, LacZ degrade le lactose et non le glucose, et dans cette methode particuliere, le gene lacZ est incomplet, et ne peut pas par lui meme degrader le lactose. Il va complementer un autre bout du gene lacZ qui est present sur le chromosome. Pour finir, la degradation du lactose ne donne pas une coloration bleue, c'est la raison pour laquelle on ajoute dans le milieu du culture non pas du lactose, mais du X-Gal qui est un analogue clivable par LacZ et qui est bleu lorsqu'il est clive.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[zendub]

merci bien je retrouve les termes de mon cours !

Bref je pense que vous allez le valider !

Polylinker

le plasmide pUC possède une zone portant un nombre important d'initiateur au clonage. Si j'ai compris lorsque qu'il y a qu'un seul site de restriction, l'insertion de l'insert ne se fait pas forcement à l'endroit souhaité c'est à dire au plus près de ce site !

Dans le pUC le fait d'avoir un nombre important de ces sites augmente les "chances" que l'insert soit placé très proche d'un site.

Est-ce bien cela ?

[jmbowie]

merci bien je retrouve les termes de mon cours !

Bref je pense que vous allez le valider !

Polylinker

le plasmide pUC possède une zone portant un nombre important d'initiateur au clonage. Si j'ai compris lorsque qu'il y a qu'un seul site de restriction, l'insertion de l'insert ne se fait pas forcement à l'endroit souhaité c'est à dire au plus près de ce site !

Dans le pUC le fait d'avoir un nombre important de ces sites augmente les "chances" que l'insert soit placé très proche d'un site.

Est-ce bien cela ?

Polylinker= MCS= Multiplie Cloning Site= Région d'un vecteur contenant un nombre plus important de sites de restrictions.
Cette région est placée en amont du gène de lacZ (d'une partie seulement en fait, lacZalpha) de sorte que si le fragment à cloner a intégré le vecteur, il décale le cadre de lecture de ce peptide qui n'est plus synthétisé; donc en présence de X-gal, pas de coloration bleue (voir explication plus haut).
Pour cloner, on "ouvre" le site de clonage avec une enzyme de restriction qui lui est spécifique. L'insert est également digérée avec la même enzyme.
Si tu n'ouvres qu'un seul site, ton insert peut s'intégrer dans le vecteur dans les deux sens. Selon ton application, cela n'est pas forcément souhaitable.

[zendub]

hum oula

j'ai pas encore bien cerné le rôle du polylinker :s ... je suis désolé mais quel est l'interet alors d'avoir une zone comportant un nombre important de sites de restrictions ?

(j'essaie de faire des questions simples, j'y arriverai un jour j'y arriverai ... remarque faudra bien)

[zendub]

excusé mon avidité de réponse je m'avance un peu en vous posant une nouvelle question.

Concernant le criblage d'une banque d'ADNc il existe plusieurs manières :

soit on utilise une sonde complémentaire au fragments d'adn. dans ce cas on connais déjà le fragments d'adn souhaité ?

si on connais la protéine synthétisé, on la digère avec une protéase puis séquencage aa ce qui permet de retrouver le fragment d'adn et donc le clone.

Enfin, à l'aide d'Ac on peut marquer la protéine synthétisé au niveau de nos bactéries

Est-ce bien cela ? :s

[jmbowie]

hum oula

j'ai pas encore bien cerné le rôle du polylinker :s ... je suis désolé mais quel est l'interet alors d'avoir une zone comportant un nombre important de sites de restrictions ?

(j'essaie de faire des questions simples, j'y arriverai un jour j'y arriverai ... remarque faudra bien)

Chaque enzyme de restriction reconnait un motif particulier au sein duquel elles peuvent catalyser la coupure du fragments. L'intérêt d'avoir une zone précise dans lequel se chevauchent des sites pour pleins d'enzyme te permet:

- de t'assurer de l'endroit (de la position par rapport à ton gène lacZ, par exemple) ou tu vas intégrer ton insert dans le vecteur
- si ton insert se trouve dans un fragment d'ADN bordé de sites reconnus par les mêmes enzymes, tu vas pouvoir isoler ce fragment de ton ADN de départ (par restriction) et le coller (ligaturer) dans ton vecteur.
S'il n'y avait qu'un seul site de clonage, tu aurais une grosse contrainte sur ton ADN de départ et donc presque jamais la possibilité de le découper pour en isoler ton fragment d'intérêt (ou alors, tu aurais à l'amplifier avec de amorces portant le site de restrictions, ce qui est plus lent et peut génerer des erreurs)

[zendub]

hum d'accord, en fait l'interet du polylinker est qu'il porte une nombre important de sites de restriction DIFFERENTS ?

par conséquent ça augmente les chances de trouver des sites de restrictions correspondant aux sites qui bordent notre insert ?

[invite9eab997a]

oui c'est ça.
Imagine, si tu n'as qu'un site EcoRI sur ton plasmide et pas de site EcoRI dans l'insert, c'est rapé.
Par contre, si tu as le choix de plusieurs sites, tu arrives généralement à te débrouiller. En plus, je crois me souvenir que ça te permet d'orienter ton insert: si tu ouvres ton plasmides en EcoRI/BamHI (au pif), ton insert ne pourra s'insérer que dans un seul sens. Par contre, avec juste un site, rien ne te garantit le sens d'insertion.
Et enfin, avec 2 sites d'ouvertures, moins de risques que le plasmide ne se referme sur lui meme donc une plus grande efficacité.

[zendub]

ok merci bien pour ces réponses

En ce qui concerne le criblage des banque d'ADNc ? (cf plus haut)

[zendub]

Re bonjour

J'ai encore une petite question.

J'ai remarqué que le polylinker se situait avant le gène LacZ sur le plasmide pUC. Donc notre insert sera forcement au niveau de ce polylinker et par conséquent avant le gène lacZ ... Or si j'ai bien compris on veux aussi placer l'insert à l'intérieur du gène lacZ pour "l'empécher" d'exprimer des protéines dégradant le lactose !

Donc voila il y a un hic ! je me suis trompé ou j'ai mal noté qq chose mais je ne sais pas quoi- !-

[jmbowie]

Re bonjour

J'ai encore une petite question.

J'ai remarqué que le polylinker se situait avant le gène LacZ sur le plasmide pUC. Donc notre insert sera forcement au niveau de ce polylinker et par conséquent avant le gène lacZ ... Or si j'ai bien compris on veux aussi placer l'insert à l'intérieur du gène lacZ pour "l'empécher" d'exprimer des protéines dégradant le lactose !

Donc voila il y a un hic ! je me suis trompé ou j'ai mal noté qq chose mais je ne sais pas quoi- !-

Tu as dû te tromper, ou le schéma que tu as est trompeur. Dans cette série de vecteurs, la MCS est bien DANS le gène lacZ, mais au début. La preuve:
http://images.google.fr/imgres?imgur...3D0qL%26sa%3DN

[zendub]

ha oui je me suis trompé, en fait j'avais pas vu la toute partie du LacZ qu'il y a après le polylinker ! autant pour moi

[invite4b7a07bd]

Bonjour!
Quant à moi je nage un peu car si vos explications sur le gène lacZ me semblaient claires, je ne comprends plus rien de l'experience réalisée dans un article (http://dev.biologists.org/cgi/reprint/131/4/933.pdf), ou lacZ est inséré en plein milieu du gène d'interet et non l'inverse. Dans ce cas je ne comprends pas bien comment on va pouvoir effectuer une selection...Par ailleurs pourquoi utilise t-on la toxine diphtérique alors que l'on a déja un gène de résistance à un antibiotique pour la selection négative...enfin je ne saisis pas bien la difference entre vecteur cible et allèle cible
(pardonnez mon ignorance je suis en médecine et je suis un master en parallèle, je m'aperçois que j'ai quelques lacunes..)