Principe alpha complemetation PGEMT

[inviteda9984d6]

Bonjour,

J'utilise le vecteur de clonage PGEM T pour cloner des produits PCR. Comme vous devez le savoir, ce vecteur est prêt à l'emploi : il a été ouvert par EcoR V et une thimidine a été ajoutée en 3' des deux extrémités.
Si un insert est inséré dans le vecteur, le gène LacZ n'est pas fonctionnel, il n'y a pas alpha complémentation, la bêta galactosidase n'est pas exprimée et les colonies sont blanches.
Mais s'il n'y a pas d'insert, est ce que le vecteur se referme pour exprimer le gène LacZ nécessaire à l'alpha complémentation ?
Si oui, comment ? En effet, il a un T en 3' de ses extrémités, il faudrait donc des A pour permettre une recircularisation du vecteur.

J'espère que ma question est claire et surtout que quelqu'un saura me répondre.

A bientot
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[invitec9f0f895]

salut

normalement le vecteur ne peut pas se refermer. S'il se referme alors il y a de fortes chances que les extremités aient ete abimées.

Yoyo

[invitebe46e0cf]

bonjour

Le vecteur pGEM-T (fig.B-1) est utilisé pour cloner des produits de PCR. Ils sont
préparés par le fournisseur Promega en coupant les vecteurs pGEM-5Zf(+) avec EcoR V et en
leur ajoutant un résidus thymidine à chaque extrémité 3’. Ces 3’-T cohésifs sur une seule base
au niveau du site d’insertion améliorent l’efficacité de la ligation de produits de PCR en
empêchant la recircularisation du vecteur et en offrant une extrémité complémentaire des
produits PCR produits par certaines Taq polymérases qui ajoutent un résidu désoxyadenosine
aux extrémités 3’ des fragments amplifiés.
Le pGEM-T est un vecteur « high copy » composé de la séquence oriC, du gène amp
responsable de la résistance à l’ampicilline, de l’opérateur lac suivi d’une sous-unité de la β-
galactosidase. Il possède également les promoteurs reconnus par les RNA polymérases T7 et
SP6 des deux cotés du « polylinker », ce qui permet une éventuelle transcription in vitro. Ce
« polylinker » est lui-même inséré dans la région codante de la sous-unité α de la β-
galactosidase. L’insertion d’un produit de PCR inactive ce gène, ce qui permet de sélectionner
les clones recombinants par criblage coloré sur des boites de Petri contenant l’indicateur
coloré X-Gal et de l’IPTG induisant le gène par l’intermédiaire de l’opérateur lac.

le pGEM T ne se referme donc pas sur lui même.

bonne chance

[gorben]

Salut,

Oui ton vecteur peut se refermer. C'est pas frequent mais ca arrive. Les raisons sont multiples, c'est toujours comme ca en Bio mol, on ne sait jamais trop ce qui se passe.

- La compagnie fabrique un "T-vecteur", mais il est impossible de verifier que 100% des vecteurs sont corrects, alors tu en as toujours un peu qui n'ont pas de T...
- Le vecteur est vieux et a force de congeler/decongerler a perdu son T.
- Il te reste une activitee proofreading dans ton produit PCR.
- Les nucleotides restants de ta PCR viennent se coller au petit bonheur la chance et la ligase va refermer un plasmide

En fait y'a pleins d'explications, de la plus logique a la moins logique.

Meme si theoriquement le vecteur ne peut pas se refermer, en pratique c'est different.
Ca reste tout de meme assez faible.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteda9984d6]

Bonjour,

Tout d'abord, merci à tous pour vos réponses très pertinentes. Je ne m'attendais pas à des réponses aussi rapidement, MERCI !

Ce que j'en retiens c'est que le vecteur est fait pour ne pas se recirculariser sauf s'il est abimé.

On est d'accord que l’insertion d’un produit de PCR inactive le gène de la B-galactosidase, ce qui permet de sélectionner les clones recombinants par criblage coloré.

En considérant que le vecteur est tout neuf, en bon état....en théorie, il ne se referme pas.
S'il n'y a pas d'insert, le gène de la B-Galactosidase est quand même inactivé (puisque le vecteur est ouvert)
Cela signifie que les vecteurs ne contenant pas d'insert donnent des colonies blanches ?

Je pensais que les vecteurs ne contenant pas d'insert donnaient des colonies bleues parce qu'il se refermait (mais je ne voyais pas comment) et permettait ainsi l'expression de la B-Gal.

Une autre hypothèse : le vecteur ne peut pas entrer dans la bactérie s'il est sous forme linéaire ?

Je suis désolée d'insister mais il y a encore quelque chose qui m'échappe....

A bientôt

[invitec9f0f895]

Salut

Si le vecteur n'est pas circulaire il ne peut pas se repliquer il ne donnera donc aucune colonie. Tes colonies ont donc forcément un plasmide circulaire, soit il est blanc (pour les diverse raisons invoquées), soit il est bleu car par expl il n'est coupé a 100% (ce qui est peu probable dans le cas d'un plasmide acheté, mais frequent quand on le prepare soit meme).

YOyo

[inviteda9984d6]

Mais bien sûr !

C'est logique !...je me demande comment j'ai fait pour zapper ça et vous embêter avec mes questions !

Merci Yoyo !

[invite6e559782]

Bonsoir g une question : quel est le principe de alpha-complementation utiliser par les plasmides PUC et qui permet la sélection des clones recombinants grace a la lac-z??? Svp c urgent

[invitec9f0f895]

Bonsoir g une question : quel est le principe de alpha-complementation utiliser par les plasmides PUC et qui permet la sélection des clones recombinants grace a la lac-z??? Svp c urgent

On est sur un forum ici, pas sur un tchat. formuler correctement ses questions est la meilleure facon d'obtenir une réponse...

Sur ce bonne recherche.
YOyo