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Immunoblot



  1. #1
    biscotte91

    Immunoblot


    ------

    Coucou tout le monde,

    j'aimerais une confirmation :

    est ce que le southern blot est bien une électrophorèse faite avec des fragments d'ADN

    le northern blot avec des ARN

    et le western-blot avec des protéines ??

    merci parce que je m'embrouille un peu....

    -----

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  3. #2
    LXR

    Re : immunoblot

    C'est tout à fait ça. Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité). C'est donc une variante du SDS-PAGE, car c'est toujours une électrophorèse de protéines sauf qu'on n'est pas en conditions dénaturantes et qu'on détecte avec un anticorps. Pour Northern et Southern, je suppose que tu sais.

    Greg

  4. #3
    Vinc

    Re : immunoblot

    Salut!
    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    Et pour le western, on détecte les protéines avec un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, cet anticorps lui-même porteur d'une activité détectable (fluorescence, activité enzymatique, radioactivité).
    Non pas forcément! Tu peux très bien utiliser un anticorps secondaire qui détecte le fc de ton anticorps primaire, c'est d'ailleurs ce qui ets majoritairement utilisé.


    Citation Envoyé par LXR Voir le message
    C'est donc une variante du SDS-PAGE, car c'est toujours une électrophorèse de protéines sauf qu'on n'est pas en conditions dénaturantes et qu'on détecte avec un anticorps.
    ????? Je ne comprends pas du tout ce que tu veux dire. Que tu détectes avecun anticorps ou deux tu peux te placer en conditions dénaturantes.
    Le SDS PAGE ne donne pas d'indication sur la méthode de détection.

    A+
    Vinc
    Primum non nocere.

  5. #4
    LXR

    Re : immunoblot

    Oui c'est vrai que je me suis mal exprimé. Je voulais dire que l'étape précedent un western est un SDS-PAGE, sauf qu'on ne se place pas obligatoirement en conditions dénaturantes (donc dans ce cas, il vaut mieux utiliser l'expression de "gel migration" que SDS-PAGE). Mais vu que je ne voulais pas embrouiller biscotte91, j'ai pris un raccourci pas tout à fait exact.

    Et en effet l'utilisation d'un anticorps secondaire reconnaissant l'anticorps primaire est désormais utilisé la plupart du temps (pour ne pas dire tout le temps ), mais là encore j'ai voulu simplifier pour que ce soit compréhensible, en introduisant en même temps la notion de détection par anticorps couplé à une activité physique, chimique ou biochimique détectable .

    Cordialement,

    Greg

  6. #5
    Toll

    Re : immunoblot

    bonjour,

    quand on parle de western blot, par defaut on parle de la technique en condition denaturante ( avec SDS et beta mercapto ou DTT).

    si on est pas en conditions denaturantes, cela sera preciser comme "native gel migration" dans les publis.
    toll

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    biscotte91

    Re : immunoblot

    oh merci !! que vous etes forts !!

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  10. #7
    Yoyo

    Re : immunoblot

    je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

    Yoyo

  11. #8
    Toll

    Re : immunoblot

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

    Yoyo
    a quand le eastern blot?
    migration de lipides (autres que chromato), de glucides?

  12. #9
    Tiscarab

    Re : immunoblot

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    je rajouterai juste pour finir que c'est Southern-blot (avec une majuscule) alors que les autres n'ont pas de majuscule, car c'est Monsieur Southern edwin qui a mis au point la technique en 1970 alors que les autres, western (1980), northern n'ont été baptisées que pour faire un clein d'oeil.

    Yoyo
    Salut!
    Yoyo, juste pour t'embêter, tu mets un P majuscule à poubelle?!!

    sinon les conditions dénaturantes sont remplies par l'utilisation de SDS, le 2-mercaptoethanol et le DTT c'est encore autre chose!
    ++

  13. #10
    yasss

    Re : immunoblot

    Bjr je voulais savoir si le western immunoblot c'est bien ce que je pense où si je me trompe.

    on fait tout d'abord une identification des protéines dans des extraits cellulaires à partir:
    d'une électrophorèse c'est à dire séparation des protéines chargées sous l'effet d'un courant électrique.
    ensuite on fait une immunodétection soit par la méthode directe ou indirecte:
    méthode directe:
    on utilise un AC Iaire marqué qui va fixé la protéine lui mm portant une enzyme qui va catalysé un substrat en un produit qui sera colorée
    méthode indirecte:
    on utilise un AC IIaire qui va reconnaitre AC Iaire. AC IIaire a lui ossi l'enzyme

    ensuite on révèle les protéines et c'est là que je ne comprends pas trop mon cours ce que j'ai l'impression de comprendre c'est qu'on fait encore une électrophorèse puis une autoradiographie... est ce exact??

    merçi!!

  14. #11
    Vinc

    Re : immunoblot

    Bonjour!

    Citation Envoyé par yasss Voir le message
    on fait tout d'abord une identification des protéines dans des extraits cellulaires à partir:
    d'une électrophorèse c'est à dire séparation des protéines chargées sous l'effet d'un courant électrique.
    Une "identification" n'est pas le bon terme. On charge sur un gel un lysat cellulaire (par exemple) contenant des protéines. Ces protéines vont être effectivement dénaturées (ou pas d'ailleurs, tout dépend de ce que l'on veut voir) et chargées négativement. Le courant électrique permet de faire migrer toutes les protéines dans le même sens (puisqu'elles ont toutes la même charge) et de les séparer selon leur masse moléculaire. La migration à traver le gel va dépendre de l'encombrement stérique de la protéine (et donc de sa masse moléculaire) : plus la protéine est petite/légère plus elle va migrer loin, plus elle est grosse/lourde et moins elle parcoura de distance après avoir été déposée sur le gel.


    Citation Envoyé par yasss Voir le message
    ensuite on fait une immunodétection soit par la méthode directe ou indirecte:
    méthode directe:
    on utilise un AC Iaire marqué qui va fixé la protéine lui mm portant une enzyme qui va catalysé un substrat en un produit qui sera colorée
    méthode indirecte:
    on utilise un AC IIaire qui va reconnaitre AC Iaire. AC IIaire a lui ossi l'enzyme
    Oui c'est cela.
    A noter que l'on utilise majoritairement la méthode indirecte, qui a l'avantage d'amplifier le signal car plusieurs anticorps secondaire peuvent se fixer sur le même anticorps primaire.


    Citation Envoyé par yasss Voir le message
    ensuite on révèle les protéines et c'est là que je ne comprends pas trop mon cours ce que j'ai l'impression de comprendre c'est qu'on fait encore une électrophorèse puis une autoradiographie... est ce exact?
    Non, l'immunodétection que tu as décrit juste au dessus (directe et indirecte) est la dernière étape, et porte aussi le nom d'autoradiographie.
    Entre la migration sur gel et l'autoradiographie tu as en plus une étape "d'électro-transfert" qui comme son nom l'indique permet simplement de transférer les protéines du gel vers une membrane (que tu vas ensuite utiliser pour faire l'autoradiographie), encore une fois grace à un champ électrique (car le sprotéine sont toujours chargées négativement).
    Si on résume:
    - chargement des protéines sur un gel
    - migration
    - transfert
    - autoradiographie

    Est-ce plus clair?

    V.
    Primum non nocere.

  15. #12
    yasss

    Re : immunoblot

    oui merçi beaucoup!!

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  17. #13
    yasss

    Re : immunoblot

    oui merçi beaucoup!! mais pour j'ai une petite précision quand àla migration et le transfert ce ne seraient pas la même chose ?
    pour moi la migration se fait sur un support ( donc le gel) sous l'effet du courant..... donc elle inclut le transfert ( le transfert étant la migration du - vers le + en foction du Poids Moléculaire)

    merçi.
    dsl j'ai encore une petite quand on fait une électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes la migration se fait en fonction du poid moléculaire(PM) de la charge et de la forme je ne voit pas comment est ce qu'on peut le faire?
    comment en fait migrent les protéines si il y a autant de critères du - vers le + parce que d'après moi les protéines chargées négativement vont migrer vers le pole + et c'est l'inverse pour les protéines chargées +, mais plus elles ont un PM faible plus elle migre vers le + et qu'inclut la forme???

  18. #14
    Vinc

    Re : immunoblot

    Citation Envoyé par yasss Voir le message
    oui merçi beaucoup!! mais pour j'ai une petite précision quand àla migration et le transfert ce ne seraient pas la même chose ?
    pour moi la migration se fait sur un support ( donc le gel) sous l'effet du courant..... donc elle inclut le transfert ( le transfert étant la migration du - vers le + en foction du Poids Moléculaire)
    Non. La migration c'est lorsque le sprotéines migrent selon leur masse moléculaire dans le gel. Ensuite le transfert permet de changer ce sprotéines de support : on les passe du gel à une membrane. Le transfert utilise aussi le courant électrique mais ce n'est pas comme la migration.

    Citation Envoyé par yasss Voir le message
    dsl j'ai encore une petite quand on fait une électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes la migration se fait en fonction du poid moléculaire(PM) de la charge et de la forme je ne voit pas comment est ce qu'on peut le faire?
    comment en fait migrent les protéines si il y a autant de critères du - vers le + parce que d'après moi les protéines chargées négativement vont migrer vers le pole + et c'est l'inverse pour les protéines chargées +, mais plus elles ont un PM faible plus elle migre vers le + et qu'inclut la forme???
    Non. Les protéines sont TOUTES dénaturées et sont linéaires donc la forme comme tu dis n'est pas un problème. Elles sont également TOUTES chargées négativement. Le pôle - est en haut et le pôle + en bas. Donc les protéines sont déposées en haut du gel et migrent du haut vers le bas à travers le gel. Lorsque l'on arrête le courant électrique et que la migration s'achève, les protéines légères auront migré plus vite et seront donc en bas du gel alors que les lourdes seront plus en haut du gel.

    V.
    Primum non nocere.

  19. #15
    yasss

    Re : immunoblot

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    Non. Les protéines sont TOUTES dénaturées et sont linéaires donc la forme comme tu dis n'est pas un problème. Elles sont également TOUTES chargées négativement.
    désolé mais je ne comprends pas pourquoi est ce que les protéines sont toutes dénaturées alors qu'on est en condition non dénaturantes et pourquoi est ce que elles sont toutes chargées négativement?

  20. #16
    piwi

    Re : Immunoblot

    Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.

    Donc dans un WB on est toujours en conditions dénaturantes. Toutes les protéines sont chargées.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  21. #17
    melancia

    Re : Immunoblot

    Bonjour !
    J'aurai besoin d'une petite confirmation ^^ : si j'ai bien compris Western Blot, Southern Blot et Northern Blot sont tous "rangés" dans une même famille : les immunoblots ?

  22. #18
    piwi

    Re : Immunoblot

    Non. Seul le western utilise des anticorps.
    C'est la famille des blots (si vous voulez). Elle permet de faire une première étude du génome et de son expression.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

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  24. #19
    melancia

    Re : Immunoblot

    ok. alors, dans ce cas peut-on affirmer que WB = immunoblot ?

    Merci beaucoup !

  25. #20
    piwi

    Re : Immunoblot

    Oui, en gardant à l'esprit que l'inverse n'est pas forcément vrai. Il existe aussi le dot blot, par exemple, qui, quand il est appliqué au protéine est aussi un immunoblot.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  26. #21
    melancia

    Re : Immunoblot

    Ok !! merci beaucoup !!!
    Et merci pour le site !!
    Bonne soirée

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