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suggestions sur clonage site de restriction




  1. #1
    sarra672

    suggestions sur clonage site de restriction

    Bonjour

    j'aurais voulu avoir quelques hypothèses à propos de ce problème de clonage:

    je voudrais insérer mon insert dans un vecteur pcDNA. une digestion avec 2 enzymes de restriction EcoRI et XbaI a permis d'extraire mon insert contenu dans un vecteur de clonage pGEM et d'autre part de linéariser le pcDNA vide.
    L'insert et le vecteur ayant des extrémités cohésives, il est possible après qu’elles se soient reconnues, de les lier l'une à l'autre par une réaction de ligation.
    mais Le clonage n’a pas aboutit
    j'ai réalisé un test de clivage par l’enzyme XbaI du pGEM/insert mais je constate que la digestion ne se fait pas.
    sachant que ce n'est pas un problème d'enzyme et que le site de restriction est bien présent car vérifié par séquançage, quelles peuvent être les raisons de ce problème?

    merci pour votre aide!!


    sarra

    -----


  2. #2
    Jean-Luc P

    Re : suggestions sur clonage site de restriction

    Si la séquence est méthylée, ce qui arrive fréquemment avec la séquence XbaI, l'enzyme ne fonctionnera pas.

    Il faut amplifier le clone dans une bactérie dam-, par exemple stbl2, pour pouvoir ensuite le digérer par Xba I.
    cf http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0222.asp et http://www.neb.com/nebecomm/products/productR0145.asp
    La séquence de Xba finit par GA, et dans de nombreux vecteurs il y a T et C derrière.
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  3. #3
    sarra672

    Re : suggestions sur clonage site de restriction

    merci beaucoup pour cette réponse!

    cordialement
    sarra


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