Viabilité d'une bactérie et ARN

[invite2406a0a9]

Bonjour,

Dans le cadre d’une manip je dois étudier la capacité de réplication (viabilité) d’une bactérie. La manip proposée est d’effectuer une RT-PCR pour rechercher la présence d’ARN.
Le problème est que dans une publication les auteurs ont recherché la présence d’ARNr. Or, pour moi l’ARN ribosomal est présent tout le temps (contrairement à l’ARNm) et donc ce n’est pas parce qu’on en trouve que la bactérie est toujours vivante.
A moins que cet ARNr ne soit présent que lors de la traduction.
Merci de m’éclairer.
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[invitec9f0f895]

Bonjour,

Je pense que l'ARNr est relativement stable, de plus il est constitutivement exprimé dans les cellules (il y a bien une baisse lors de l'entrée en phase stationaire).

Je ne pense pas que verifier la presence de cet ARNr te permette de t'assurer de la viabilite de la bacterie. Sans compter que l'ARNr est l'ARN majoritaire dans les cellules, donc meme si il n'est activement transcrit que dans les cellules en division, il est stable et la demie-vie du ribosome est importante. Tu le retrouveras donc meme dans les cellules non viables.

pourquoi ne pas faire une "simple" culture de la bacterie concernée afin de tester sa viabilite?

Maintenant quelquechose m'a peut etre echapé.
Yoyo

[invite2406a0a9]

Merci Yoyo pour la réponse rapide.

pourquoi ne pas faire une "simple" culture de la bacterie concernée afin de tester sa viabilite?

En fait je ne suis pas rentré dans les détails : la bactérie étudiée est Chlamydia trachomatis (bactérie à multiplication intracellulaire......d'où culture cellulaire), et un des buts du travail est de comparer plusieurs techniques (dont la RT-PCR)
Voili, voila....

[invite20371daa]

Salut,
Je m'intéresse aux bactéries et à leur culture dans le cadre de mes Tipe. Ainsi, je suis très intriguée par la "technique RT-PCR"... Qu'est-ce??
Merci de m'éclairer.

Claire.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

>Meningo.

Ah oui je vois le probleme sinon j'aimerai nuancer ce que je disais car je viens de penser a un truc. Si dans ta technique d'extraction tu as un moyen d'isoler specifiquement les ARNr néosynthétisé (et pas ceux qui sont deja engagés dans le ribosome) alors tu devrais pouvoir dire que tes cellules transcrivent toujours leur ARNr.

>Clr
La RT-PCR correspond a une PCR qui a été précédée d'une étape de rétro-transcription (ARN ->ADNc). cela permet d'amplifier les ARN.

Yoyo

[invite20371daa]

Merci beaucoup pour la précision sur RT mais j'aurai aimé avoir une explication sur PCR également... Merci.

Clr

[invitec0db17c6]

PCR = Polymerase Chain Reaction.

La PCR sert à amplifier (à le faire se répliquer plusieurs fois) de l'ADN de manière très importante. Une polymérisation est le mécanisme (naturel) pour "construire" une molécule. Ici la polymérisation de l'ADN consiste à ajouter un nucléotide derrière l'autre. Et ceci pour fabriquer plusieurs copies de l'ADN étudié.

[invite2406a0a9]

Je sors d’une petite réunion où on a parlé de ce fameux ARNr (plus particulièrement ARNr16S bactérien). On m’a comfirmé à plusieurs reprises (et par plusieurs personnes) que cet ARNr n’est retrouvé que lors de la réplication de la bactérie et qu’il a une demi-vie courte (donc qu’il n’est pas retrouvé dans une bactérie morte contrairement à l’ADN).
Ils m’ont dit également que le but premier de son amplification (et de sa quantification) est de « calibrer » une manip au cours de laquelle on a extrait de l’ARN…..en gros pour voir si la technique d’extraction a bien marché (et pas pour apprécier la capacité réplicative d’une bactérie).
….Je ne sais plus trop quoi penser.


Toujours dans le même domaine j’ai une petite question : pour amplifier un ARNm, est-ce qu’on peut utiliser les mêmes amorces que celles utilisées pour amplifier l’ADN correspondant. Je pense que oui, mais j’aimerais avoir confirmation.
Merci

[invitec9f0f895]

Bonsoir

Si plusieurs personnes t'ont confirmé que l'ARNr etait peu stable et present que dans les bactéries en multiplication, c'est alors probablement vrai...meme si ca me surprends connaissant la stabilite du ribosome.
C'est vrai qu'en general on s'en sert pour qualibrer car comme je le disais précédemment, le taux d'expression est relativement constant, donc ca joue le role d'un étalon dans tes mesures.

En ce qui concerne les amorces en effet ce sont les memes qui sont utilisées pour amplifier l'ARNm et l'ADN. si tu es chez un eukaryote, alors tu les choisis de part et d'autre d'un intron, comme ca en fonction de la taille tu es certain de ne regarder que l'ARNm (a cause de l'épissage). Sinon il te faut les bons temoins pour etre sur que ton echantillon est bien traité a la DNAse et qu'il ne reste plus de trace d'ADN.

Yoyo

[invited8287251]

Bonsoir

Si plusieurs personnes t'ont confirmé que l'ARNr etait peu stable et present que dans les bactéries en multiplication, c'est alors probablement vrai...meme si ca me surprends connaissant la stabilite du ribosome.
C'est vrai qu'en general on s'en sert pour qualibrer car comme je le disais précédemment, le taux d'expression est relativement constant, donc ca joue le role d'un étalon dans tes mesures.

En ce qui concerne les amorces en effet ce sont les memes qui sont utilisées pour amplifier l'ARNm et l'ADN. si tu es chez un eukaryote, alors tu les choisis de part et d'autre d'un intron, comme ca en fonction de la taille tu es certain de ne regarder que l'ARNm (a cause de l'épissage). Sinon il te faut les bons temoins pour etre sur que ton echantillon est bien traité a la DNAse et qu'il ne reste plus de trace d'ADN.

Yoyo

Tout a fait, mais fait ,en témoin négatif, une PCR sur un échantillon qui a subit le même traitement sauf que tu ne mets pas le RT, pi la c'est cool (si tu n'as pas de bandes)!

[invitec9f0f895]

Bonsoir,

Il faut faire attention que certaines Taq polymerase vendues possedent une activité reverse transcriptase non negligeable ce qui peut induire une mauvaise interpretation des resultats.

yoyo

[invited8287251]

YOYO,Laquelle???????
Ceci dit d'ou l'intérêt de faire tous les contröles possibles et inimaginables lorsque l'on fait de la PCR!!!!
Et là je connais un paquet d'artéfacts!
En plus j'ai des manips de Races qui marchent plus,
Euhh pas moi!!! l'étudiante en thèse!!!!

[invite2406a0a9]

Bonjour,

J’ai un peu de mal à faire fonctionner mes neurones ce matin mais je vais essayer :

Il faut faire attention que certaines Taq polymerase vendues possedent une activité reverse transcriptase non negligeable

Pour vérifier l’absence d’ADN (dans le cadre d’une RT-PCR), est-ce que ça ne serait pas mieux d’éliminer l’étape de RT dans le programme RT-PCR au lieu d’enlever la RT (l’enzyme) afin de ne pas être gêné par ces fameuses Taq polymérases dont tu parles ?

[invited8287251]

Nan, car ces sont tu auras des l'insatant où tu mets la RT dans le tube il ya aura tjrs un peu d'activité, même dans la glace.

[invite2406a0a9]

Nan, car ces sont tu auras des l'insatant

.......C'est quoi comme langue??

Et si on enlève la RT (enzyme) ainsi que le programme RT, est-ce que là c'est possible?....Mais là je trouve qu'on enlève trop de choses, ce n'est donc plus trop un contrôle

[invitec9f0f895]

>9herve.
Avant de te donner une liste, faudrait que je recherche mes tests. Mais je sais que celle qui est(etait?) vendue par Pharmacia,avait une telle activité reverse transcriptase, que je n'avais meme pas besoin de l'enzyme RT pour amplifier mes ARN!...

>Meningo.
Ton meilleur controle est définitivement un control dans lequel tu traites ton echantillons a la RNAse...car si dans ce cas le signal disparait alors c'est que ton produit d'ampli venait des ARN, en revanche si il y a quelquechose, c'est que tu as toujours de l'ADN contaminant.
Ce que tu proposes (enlever l'enzyme RT), ne resoud pas le problème si ta Taq-polymerase possede une activité reverse transcriptase, dans tes témoins tu auras toujours une ampli...tu en conclueras que ton echantillon est contaminé par de l'ADN, alors qu'en réalité il n'en n'est rien.

Yoyo

[invite2406a0a9]

OK
Merci pour les tuyaux

[invited8287251]

Yoyo,
ça c'est économique s'il ya les deux activités! ceci-dit, moi si je vois ça , je leur dit que leur enzyme est une daube et je me fais rembourser!
Par contre comme la taq est produite en bactérie, je ne vois pas très bien d'où peut venir l'activité RTase qui est co-purifiée? Ya des RT chez les bactéries come chez les eucaryotes?

[invite2406a0a9]

Bonjour,

Je relance le sujet car je suis confronté au problème dont on parlait : les PCR de contrôle faites sur les ARN sont positives, donc soit la Taq utilisée a une activitée RT (NON dixit le fabricant) ou alors il reste de l'ADN résiduel.
Comme tu me l'as conseillé Yoyo il faudrait tester mes extraits en les traitant à la RNAse, d'où ma question (de pauvre petit novice) : est-ce qu'on peut être sûr que la RNAse a bien détruit tous les ARN?

[invitec9f0f895]

Bonsoir,

Quelle taq utilises tu ? en general les taq fideles ont moins/pas d'activité RT que la taq "normale".

Pour répondre a ta question, les RNAse sont tres actives et a moins d'avoir des "tonnes" d'ARN il est tres peu probable que les ARN ne soient pas dégradées (surtout quand on sait qu'en general les RNases sur les mains suffisent a dégrader ta prep).

Ceci etant dit tu peux verifier au spectro que tes ARN sont bien degradés vu que l'ARN n'absorbe pas comme les nucleotides. Ou en deposant sur gel (si tu as bcp d'ARN).

yoyo

[invite2406a0a9]

Merci yoyo.
Concernant la Taq, je ne sais pas trop (elle fait partie d'un kit de PCR en temps réel)
Sinon, j'ai une petite dernière question (pour la route) : si j'ai bien compris, dans les kits d'extraction de l'ARN on utilise un inhibiteur de RNAse (RNAsine?), est-ce qu'il ne va pas empecher l'activité d'une RNAse qu'on ajouterait à l'extrait?

[invitec9f0f895]

Bonsoir,

Si ca risque de poser un probleme. d'un autre coté, si tu utilises 1ul de ton extrait d'ARN dans 20ul final. Il y a des chances que ton inhibiteur soit suffisament dilué pour ne pas inhiber totalement la RNAseA (d'autant qu'en general tu n'utilises pas des tonnes d'inhibiteur), ca depends des concentrations, mais de toute maniere l'inhibiteur n'est jamais suffisament efficace pour bloquer totalement les RNases
D'un autre coté si tu as isolé des ARN polyA+, tu as du te debarasser des inhibiteurs durant les lavages, dans ce cas la ca ne posera pas de probleme (dans le cas contraire tu pourras verifier que ton RNAse est active en verifiant que les ARNr sont bien dégradés.)

Yoyo

[invite2406a0a9]

OK
Merci beaucoup.

[invite2406a0a9]

Bonsoir,

Episode 58

Oouuinn, ça marche pas
Quand j’extrais mes ARN j’ai la DNAse du kit qui fait pas son job…, j’ai des tonnes d’ADN dont je veux me débarrasser.
Le truc c’est que si je rajoute de la DNAse je sais pas trop comment l’inactiver :
Phénol/chlo : je vais perdre de mes ARN, la chaleur : je pense pas que les ARN apprécient, l’EDTA : sans cations je pense que ma RT va avoir du mal……
Apparemment il existe des kits de DNAse avec tampons de lavage…..mais bon…..ça en ferait un de plus…
Que me conseillez vous ? Merci

[invitee8b3f97e]

Pour éliminer l'ADN sans toucher a l'ARN je ne vois que les DNases.

[invite2406a0a9]

Bin oui, mais mon problème c'est que je la trouve pas très vive....et quand je regarde la quantité d'ADN avant et après l'avoir mise je n'ai pas une différence énorme.

[invitec9f0f895]

Salut,

N'oublie pas que la DNAse pour etre pleinement active doit avoir des ions Mg2+.
Mais en général si tu trouves la DNAse peut active, c'est souvent qu'elle n'a pas le temps d'agir durant l'étape de purification.

Sinon pas de probleme pour inactiver les DNASe, voici le protocole (source service technique de Boerhinger)
-ARN
-6 Unites de Dnase/Rnase free
-10 a 60 min à 37°C (en moyenne 15min suffisent) en présence d'inhibiteur de la RNAse (5unites)
-tampon d'incubation 1x (0.1M Acetate de Na, 5mM MgSO4 pH5.0). Tu peux aussi utiliser le tampon de RT qui est très proche en composition.
-Inactivation de la Dnase: 5min à 90°C
FIN

Voila, sinon tu peux aussi traiter au phénol chloro, puis reprecipiter tes ARNs. Tu en perdra un peu, mais il n'y a pas de raison que tu en perdes des tonnes.

Bon courage
Olivier

[invite2406a0a9]

Merci yoyo de te pencher sur mon problème

Mais en général si tu trouves la DNAse peut active, c'est souvent qu'elle n'a pas le temps d'agir durant l'étape de purification.

Côté durée d'incubation j'ai pas mal donné...et sans succès : fabricant=1h 20°C, et j'ai fait en plus 1h 37°C, 12h 20°C et 12h 37°C...RAS.

Inactivation de la Dnase: 5min à 90°C

Et mes ARN ils risquent pas de cramer là ??

[invitec9f0f895]

De rien

Et mes ARN ils risquent pas de cramer là ??

Moi je n'ai jamais eut de probleme, il est possible que quelques % d'ARN mais bon c'est sur que si tu les laisses 3h y'aura plus rien

Yoyo

[invite2406a0a9]

OK
Comme ils sont hyper-réactifs je pensais qu'ils appreciaient pas trop la chaleur. 5 petites minutes de souffrance uniquement...