Bonjour à tous!
J'aimerai faire une électrophorèse en gel d'agarose pour faire un test qualitatif concernant mes arn extraits puis congelés dans de l'eau RNase free.
Je pense déposer 500 ng d'arn sur le gel mais je ne sais pas si cette quantité est suffisante et dans quel tampon les déposer. Les arn doivent -t-ils subir une dénaturation ou un traitement particulier avant dépot?
Merci de vos réponses.
Bonjour,
je ne vais etre d'une grande aide mais as-tu surtout prevu de travailler en condition rnase-free?? C'est important pour un gel agarose pour arn. Tout le materiel doit etre propre et le gel prepare avec des reactifs rnase free.
J'ai trouve ceci en faisant une recherche rapide:
http://www.protocol-online.org/cgi-b...che.cgi?ID=842
bonne chance
Salut
Non rien de spécial, comme l'ADN tu fais un gel TBE ou TAE avec un bleu de charge.
Si tes ARN sont beaux tu dois voir les ARNr (si ARNtotaux) et un smear.
Si il n'y a qu'un fort signal de bas poid moléculaire alors c'est qu'ils sont degradés
YOyo
Franchement moi je ne m'embête jamais avec les conditions RNase free pour faire migrer de l'ARN. De toute façon on ne se resert plus de ce qu'il y a dans le gel et il ne migre pas assez longtemps pour que la dégradation due au gel soit visible. Je module un peu en disant que je préfère faire migrer mes ARNs moins vite que les ADNs (100v alors que je peux monter jusqu'a 200v pour mes ADNs). Ceci parce que je trouve que c'est plus beau.
Sinon le gel c'est agarose 1% ou 1.5% dans du TAE et basta.
Sinon pour la quantité je mets 1µg mais 500 nano doivent aller très bien aussi et le reste c'est tout comme Yoyo l'a déjà décrit.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Merci de vos réponses si rapides, c'est très sympa!
Je pensais qu'il fallait dénaturer à tout prix l'ARN qui était en pelote avec du mops et du formaldéhyde (entre autre) à moins qu'avec un kit d'extraction l'arn ne soit déjà "déroulé".
En ce qui concerne les conditions RNase free: j'ai autoclavé mes solutions et rincé la cuve avec soude et sds puis eau stérile car je n'ai pas de DEPC. Si mes ARN sont dégradés j'adapterai de nouvelles conditions de manip.
Sinon je suis allée sur protocole online mais ils parlent de dénaturation. Comme je n'ai pas les composants genre formamide et formaldéhyde ... si je peux éviter cette étape et que ça marche je préfère tenter.
Merci encore
quand tu veux faire une analyse qualité des ARN 500ng suffisent.
Si tu peux te le permettre l'agilent est un excellent moyen.
Les gels mops formaldéhye formamide et agarose servent pour les northerns et dans ce cal là il te faudra plus que 500ng generalement 15µg)
Il faut dénaturer tout de meme les échantillone 65° 5', short spin, et charger sur gel.
je ne suis pas d'acdord avec l'idée du smear entre les bandes 28 et 18s. une bonne qualité avec 500ng ne doit pas donner de smear important.
Déjà quels sont les ratios 260/230? et 260 / 280 ?
Je pense que ce dont parlait Yoyo n'était pas une trainée blanchatre mais plutot le bruit de fond que l'on observe lorsque l'on dépose des acides nucléiques. Quelque chose de légèrement gris sur une photo. Pour 500 nano c'est vrai qu'il ne doit rien d'autre de notable que les deux bandes des ARNr.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Salut
La denaturation n'a aucune importance pour verifier la qualité de tes ARN, ca n'est important que si tu cherches a les hybrider par la suite.
et oui Les ARNm migrent sous la forme d'un smear, meme s'ils ne sont pas dégradés! les autres bandes sont les ARNr et les ARNt.
Yoyo
OK je ne fais pas de dénaturation; direct dans du TAE.
ca m'arrange car je n'ai pas beaucoup de produits destinés à la Recherche dans mon labo. Je faits juste des tests de dégradation d'ARN (en vue d'une étude clinique) pas de northern.
Mes ratios 260/280 sont tous autour de de 2,1 par contre j'aurais du noter le ratio 230.J'ai fait agir une DNase donc ça me paraissait pas utile.C'est bien lié à une conta d'ADN non?
Merci à tous
Bon je vois que des pros t'ont repondu mieux que moi
Par contre le truc du ratio 260/230, ca reflete la contamination par des solvants genre ethanol ou chloroforme. Enfin, c'est ce qu'on m'a toujours dit.... on m'aurait menti ??!! lol
Bonjour!
Merci pour vos conseils; j'en ai pris note.
Merci aussi pour le ratio 260/230 ça n'a rien à voir avec l'adn tu as surement raison.
Pour finir: j'ai déposé 1 µg d'arn + bleu sans aucune dénaturation et dans du TAE auroclavé 20 min à 121°C.
Résultats j'ai effectivement les deux bandes 28S et 18S (sauf qu'elle ont une intensité équivalente) mais un bruit de fond important.
Pour certains échantillons j'ai aussi des smear pour les hauts poids moléculaires il s'agit surement d'arn avec struct secondaire.
Peut etre que je devrait déposer moins d'arn et les dénaturer juste 5 min à 65°C.
En tout cas merci encore
Cordialement
Salut
ton smear de haut poid moleculaire est probablement de l'ADN génomique.
C'est normal que les deux bandes d'ARNr soient de meme intensité.
Yoyo
Envoyé par emma59
Les ARNr encore structurés, de ma propre expérience, se présentent plutôt sous la forme de multiples bandes nets, mais pas en un véritable Smear. Ca doit être de l'ADN génomique plutôt.
re bonjour
peux tu poster une image de ton gel ?
pour l'extraction d'ARN, le pH de ton phénol chlo doit etre 4.7 (saturation au citrate). Ensuite le ratio 260/230, qui doit être strictemnt supérieur à 2 reflète les contaminations en sels et alcools. Le phénol abborbe plutot à 270 (noyau aromatique).
Le traitement à la DNase ne modifie en rien le 230 puisque DNase = proteine donc 280, et l'ADN s'il en reste, ne peux etre visualisé.
Hello!
Merci pour les infos sur les ratios et contaminations! Cependant j'ai extrait l'ARN avec midi kit qiagen et je ne connait pas exactement la composition des tampons (je ne crois pas qu'il y ait du phénol).
J'ai extrait l'ARN sur 250 mg de tissus (placenta) comme indiqué et ça a bouché un peu les colonnes donc la DNase n'a peut etre pas été très efficace.
J'avais un meilleur rendement en ne pesant que 150 mg; même chose concernant les fois qui ne doivent pas dépasser 100 mg sinon la colonne se bouche. Je vais appeler qiagen.
Sinon j'ai refait un gel d'ARN en déposant 500 ng au lieu de 1µg et en dénaturant 5 min à 68°C: le résultat est moins beau et je n'ai pas diminué le bruit de fond excepté les smears c'est à dire une contamination d'ADN génomique potentielle.
amicalement
