Difficultés pour solubiliser de l'arn

[invitecce4751e]

Bonjour à tous,

Suite à une extraction d'ARN totaux à partir de larves de Trichinella (nématode) j'ai des difficultés pour ressolubiliser mon ARN. Mon protocole est basé sur une extraction classique au phénol-chloroforme et à la fin un lavage à l'éthanol 75% et séchage. Le séchage de mon culot s'est fait en étuve à +37°C puis resupension dans de l'eau "Rnases free". Ce qui se passe c'est que même en chauffant à +65°C au bain marie pendant 25 minutes bien que mon culot se soit désagrégé il n'est pas solubilisé. Probablement qu'il est trop sec. Auriez-vous une solution à me proposer car il faut que je récupère le maximum de mon ARN dans l'objectif d'en extraire les ARNm et de construire une banque d'ADNc. Merci.
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[gorben]

Salut,

Perso je ne seche jamais a 37 deg mais a RT. Si tu as un gros culot, essaie d'augmenter un petit peu le volume pour le resuspendre. Des fois ca aide bien !

A+

[Yoyo]

Salut

si le culot est vraiment trop sec, alors la bon courage pour le reprendre car c'est coton!
Le plus simple est de mettre ton volume d'eau voir un peu plus quitte a diluer legerement ton ARN. et tu incubes a temperature ambiante plusieurs heures. Tu peux tenter de chauffer mais l'ARN est fragile alors...

A mon avis tu perdra moins de temps a refaire ton extraction d'ARN, désolé.
YOyo

[invitecce4751e]

Merci.
En fait j'ai réussi à ressolubiliser une partie de mon culot en refaisant une extraction phénol-chlo. Néanmoins, il me reste une partie insoluble. Pensez-vous que pour faire ma banque d'ADNc je devrais refaire une extraction où je peux travailler avec mon culot dissout? En gros, j'ai peur que ne se sont dissoutes que certaines catégories d'ARN, lesquelles je ne sais pas mais c'est possible?
Merci de votre aide.

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

Faire une banque d'ADNc est quand meme un gros travail, tu vas certainement te baser sur cette banque pour des experiences futures, ce qui fait donc encore beaucoup de travail.

Perso une extraction d'ARN c'est tant de travail que ca, et ca te permet de partir sur de bonnes bases pour la suite !
Donc oui, je referai une prep d'ARN.

A+