Influence conditions RT sur PCR

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Bonjour à tous.

Je suis en train d'optimiser une PCR visant à évaluer le taux de dégradation de l'ARNm.
J'ai déjà testé avec succès les amorces et les conditions de PCR en utilisant une RT "classique" RT faite avec 1 µg d'ARN / 20 µl et oligo dT + hexamères.

Par contre, dans l'article qui me sert de référence, ils rélisent une RT avec 300 ng d'ARN/20µl + seulement oligodT. Et là, la PCR ça ne marche plus.

Pourtant en rélisant une autre PCR (faite en routine au labo avec mes RT (oligodT et 300 ng d'ARN) j'ai un signal; ce qui signifie bien que malgrè un taux plus faible d'ARN dans la RT au départ j'ai quand même de l'ADNc.

Ma question est: est-il possible que mon ADNc produit avec moins d'arn et sans hexamères amplifie pour un gène et pas pour d'autres sachant que les gènes que je dois mettre en évidence se trouvent près de la queur poly A de l'arn donc forcément retro transcrit avec les oligo dT?
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[invite1157e367]

Salut Emma,

Tu ne dis pas si tu mets aussi les hexamères. Peut etre que le problème vient de là.

A+
chouky

[invitecc2a5091]

Bonjour choucky !

Evidemment le problème vient que ma RT sans hexamères ne marche pas tandis que dans l'article ils n'utilisent justement que des oligodT. Les gènes que je veux amplifier (housekeeping gènes de surcroît) se situent près de la queue poly A donc je souhaite que la zone que je voudrais retro-transcrire se situe assentiellement à ce niveau tandis que les hexamères peuvent "shunter" cette zone. Finalement je teste toute les combinaisons possibles de RT.

Merci en tout cas.

amicalement

PS: puis-je me permettre: choucky76 ferait un peu moins "jacky" que 27 mais si vous êtes amateur de "jacky" justement venez dont par chez moi chez mes voisins du 62 !