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qPCR



  1. #1
    valkien

    Question qPCR


    ------

    bonjour a tous,
    Je me mets a la PCR quantitative en temps reelle. J'ai utilise auparavant le SYBR green et la je me mets au systeme Taqman. Pourriez vous me donner des indications sur la concentration de la sonde par rapport a celle des primers a utiliser. J'imagine aussi qu'elles doivent etre les memes pour le controle GAPDH. (j'utilise le kit applied biosystem master mix)
    Merci beaucoup

    -----

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  3. #2
    slamart

    Re : qPCR

    salut,
    en ce qui concerne le passage en sonde TaqMan à partir d'un SybrGreen, l'important est le ratio concentration sonde/concentration amorces.
    Classiquement, les concentrations amorces peuvent varier entre 300 et 900nM final. Les concentrations de sondes entre 100 et 400nM final. Les ratios les plus communs sont donc entre 1/5 et 1/2.
    De ton coté, je pense qu'il vaut mieux partir avec tes concentrations d'amorces optimisées en Sybr et caler la sonde pour le TaqMan à une concentration moyenne de 200nM final. Ensuite, faire varier la concentration de sondes entre 100 et 400 et regarder si les résultats sont corrects.
    Les autres paramètres sont modifiables si les résultats que tu obtiens ne sont pas bons...
    Bon courage

  4. #3
    valkien

    Re : qPCR

    merci bcp, je vais tenter mes premiers essais!
    a bientot

  5. #4
    belouga7

    Re : qPCR

    Citation Envoyé par valkien Voir le message
    merci bcp, je vais tenter mes premiers essais!
    a bientot
    Bonjour à tous

    Pourriez-vous m'expliquer le principe du comment on dessine les amorces pour Q-PCR ? Est-ce sur le chevauchement intron-exon ? Comment peut-on dire qu'on se départi de l'ADNc, si on part avec de l'ADnc qui provient d'une RT ?

  6. #5
    allis

    Re : qPCR

    Bonjour,

    cette question m'intéresse aussi. Et une autre qui va avec, peut être pourrez vous m'éclairer: si on veut que la PCR soit spécifique d'un microorganisme, il faut que les amorces soient spécifique: quelle est la méthode utilisée pour déterminer la séquence à amplifier?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    allis

    Re : qPCR

    je viens de me poser une autre question, peut-être stupide, dans ce cas désolée...

    Si on veut amplifier d'une part de l'ADN et d'autre part de l'ARN, serait-il envisageable de n'utiliser qu'une seule plaque PCR; de faire l'étape de rétro transcription sur la plaque entière (avec la rétro-transcriptase seulement dans les puits avec ARN) et ensuite faire l'étape d'amplification sur la totalité de la plaque?

    merci de votre aide

  9. Publicité
  10. #7
    gorben

    Re : qPCR

    Citation Envoyé par allis Voir le message
    je viens de me poser une autre question, peut-être stupide, dans ce cas désolée...

    Si on veut amplifier d'une part de l'ADN et d'autre part de l'ARN, serait-il envisageable de n'utiliser qu'une seule plaque PCR; de faire l'étape de rétro transcription sur la plaque entière (avec la rétro-transcriptase seulement dans les puits avec ARN) et ensuite faire l'étape d'amplification sur la totalité de la plaque?

    merci de votre aide
    Salut,

    Oui c'est possible, Applied Biosystem (entre autre) vend un kit qui permet de faire la RT et la qPCR dans la foulee. Par contre melanger sur une plaque de l'ADN et de l'ARN ca c'est pas terrible... tu risques d'avoir des contaminations ADN a la pelle !

    A+

  11. #8
    allis

    Re : qPCR

    merci pour ta réponse!

  12. #9
    belouga7

    Re : qPCR

    Bonsoir,

    L'étape de synthèse des amorces en vu d'un Q-PCR est très importante, c'est d'elles que découle la spécificité de ton amplicon (produit de Q-PCR). Je sais qu'il existe un logiciel qui s'appelle PrimerPremier auquel tu peux recourir en complément il faut utiliser le site PubMed pour avoir la séquence de ton gène et un site disponible gratuitement sur les site de la compagnie Roche. Tu copies la séquence de ton gène A depuis PubMed en prenant soin de bien choisir la séquence qui correspond à ton modèle expérimentale (mouse, human,...).Tu colles ensuite cette séquence dans le site Roche Applied Science probe finder, qui va alors te dessiner les introns et les exons contenus dans la séquence. Dans le logiciel Primer Premier, tu copies à nouveau la séquence de ta protéine et tu rentres à la main les positions des introns. Il faut également que tu choissise certains paramètres comme la taille de ton produit de PCR, qui doit généralement être compris entre 150 et 300 paires de bases. Il a des petits détails auquels tu dois être attentif, comme la Tm, surtout si tu envisages d'analyser plusieurs génèes différents sur une même plaque, la Tm de toutes tes amorces doit être proche.
    Avant de te lancer dans une grosse manip, teste tes amorces et leur spécificité sur 2 ou 3 puits. En Q-PCR la spécificité est facile à déterminer, tu dois avoir un seul et unique pic dans ta courbe de dissociation.
    Il doit surement y avoir une personne dans toutes celles qui utilisent l'appareil qui doit savoir se servir de ce type logiciel pour dessiner les amorces. Parce qu'il y a plein d'autres paramètres comme les deltaG...

    On se départi de l'ADNc au moment de lancer son RT, tu traites tes ARNm à la Dnase pour éliminer toute trace de ce type de contamination. Après ton RT, tu utilises uniquement les extraits pour le Q-PCR avec un matériel destiné au Q-PCR (micropipettes, tips filtres...) pour limiter les risques de contamination avec de l'ADNc qui vient d'une autre manip ou d'un PCR...

    Bonne chance pour tes manip,
    Belouga7

  13. #10
    belouga7

    Re : qPCR

    salut,

    pour que se soit spécifique d'un organisme, il faut utiliser des amorces qui reconnaissent spécifiquement la protéine X qui t'intéresse dans l'organisme en question. La seule raison qui pourrait faire que ce ne soit pas spécifique serait que cette protéine se retrouve dans d'autres, du fait de sa conservation au cours de l'évolution.
    Mais en utilisant la séquence dite depuis PubMed tout devrait rouler, bonne chance.
    Belouga7

  14. #11
    allis

    Re : qPCR

    Merci Belouga, un peu en retard, mais merci pour tous ces détails.

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