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qPCR résultats hors gamme standard!!!




  1. #1
    fenouillebzh

    qPCR résultats hors gamme standard!!!

    bonjour,
    comment expliquer des valeurs de Ct de PCR en temps réel supérieures à l'unité de copie? Je m'explique : dans une gamme standard une copie par µl sort à un Ct=30 mais mes échantillons sortent justement après. j'obient donc des resultats comme 0.01 copie par µl!!!!!!!
    quelqu'un a t il une solution?

    -----


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  3. #2
    Jean-Luc P

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Si tu travailles avec un volume de 100 µl d'échantillon, ça prend tout son sens.

    Mon petit doigt me dit que ce n'est pas le cas pourtant.
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  4. #3
    piwi

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    L'explication serait plutot que quand tu as très peu d'echantillon, la réaction se fait de façon un peu stochastique. Donc il est possible qu'une réaction se soit initiée avec un, deux ou trois cycles de retard par rapport à ce que tu pouvait esperer, donnant l'illusion qu'il y a une fraction d'echantillon dans le tube.

    Cordialement,
    piwi


  5. #4
    fenouillebzh

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    je travaille avec un volume total de 20µl (dont 2µl d'ADNc). A l'électrophorèse, il apparait une tres belle bande d'amplification (bonne taille) mais ca sort à 35 cycles alors que une copie de cet amplicon sort, d'après ma gamme standard(efficace) à 32 cycles!!!! Ce n'est pas interprétable ou alors il faut oublier la gamme?

    merci pour vos reponses précédentes.

  6. #5
    Annaick_R

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Bonjour,

    pour l'instant, tu ne peux dire que tu as quelques copies mais pas beaucoup : moins de 1 copie /µL (c'est hors gamme = pas d'extrapolation). Est-ce que c'est grave de ne pas avoir un chiffre précis ?
    De plus, 1 µL d'échantillon (ARN ou ADNc ?) représente le contenu de combien de cellules ? Ton résultat peut indiquer que 1 cellule sur 10, sur 100 ou sur 1000 exprime le gène dans ton tissu (tu travailles avec des RT ?).

    Cette valeur de Ct me fait penser à une légère contamination par de l'ADN génomique. Comme ton ARN-cible n'est pas présent, tu vois l'amplification de l'ADN génomique résiduel de ta prep.
    Pour tester cette hypothèse : si tu as une chance que la séquence de l'ADNc soit différente de celle de l'ADN génomique (intron), séquence le produit PCR.
    Si les 2 séquences sont identiques, fait une PCRq avec un couple d'amorces placé dans un intron pour contrôler le niveau de contamination par de l'ADN génomique.
    Je peux te donner un couple qui marche chez Arabidopsis thaliana (si tu travailles sur cette espèce)

    Annaïck

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Jean-Luc P

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Citation Envoyé par Annaick_R Voir le message
    Cette valeur de Ct me fait penser à une légère contamination par de l'ADN génomique. Comme ton ARN-cible n'est pas présent, tu vois l'amplification de l'ADN génomique résiduel de ta prep.
    Pour tester cette hypothèse : si tu as une chance que la séquence de l'ADNc soit différente de celle de l'ADN génomique (intron), séquence le produit PCR.
    La taille sur gel devrait suffire...
    Jean-Luc
    La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
    Salvor Hardin

  9. #7
    Annaick_R

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    La taille sur gel devrait suffire...
    Précision : comme ça risque d'être un tout petit intron (~100pb), il va falloir faire un gel à 2% d'agarose mini pour voir la différence...

    Annaïck.

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  11. #8
    fenouillebzh

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Je fais automatiquement une électrophorèse sur gel agarose 1.8% à tous nouveaux couples d'amorces utilisés. Je vérifie donc la taille de mes amplicons (qui sont bons). Je travaille sur le sang humain et de souris et sur des macrophages péritonéaux de souris. Pour les macrophages je peux savoir à peu près le nb de cellules que j'extrais mais c'est beaucoup plus dur pour le sang (globules rouges plus globules blancs). je traite mes extraits d'ARN avec de la DNAse alors j'espère qu'il n'y a pas d'ADN génomique dans mes échantillons.
    Donc, je dois extrapoler.
    Mon problème est que mon chef a fait une expérience avant que j'arrive à l'institut et il était super content de voir une amplification à 34 cycles alors que la gamme s'arête à 33 cycles!!!! moi je suis donc contre la quantification par le nb de copies!!!! et vous?

  12. #9
    Annaick_R

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Citation Envoyé par fenouillebzh Voir le message
    Mon problème est que mon chef a fait une expérience avant que j'arrive à l'institut et il était super content de voir une amplification à 34 cycles alors que la gamme s'arrête à 33 cycles!!!! moi je suis donc contre la quantification par le nb de copies!!!! et vous?
    Bonjour,
    si tu penses que le résultat de ton chef est un artéfact, tu as plusieurs moyens de le prouver.

    1) Tu fais une gamme avec des dilutions encores plus grandes, qui théoriquement devraient aller jusqu'à 35 ou 40 cycles. Si tu obtiens une gamme qui n'est plus linéaire au-delà de 33 cycles ou que toutes les courbes se superposent, on ne peut pas extrapoler. Si, au contraire, ça marche et que la gamme est linéaire, tu pourras quantifier l'expression de ta cible.

    2) Essaye de faire une PCRq avec plus d'ADNc, en espérant obtenir une amplification à moins de 33 cycles et entrer dans la gamme.

    3) Je réitère ma proposition d'estimer la quantité d'ADN génomique contaminant par un couple d'amorce situé dans un intron. C'est un contrôle de contamination et de niveau de bruit de fond imparable.

    Annaïck.

  13. #10
    fenouillebzh

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Je vais opter sur l'augmentation de µl d'ADNc à chaque PCR tps reel. Je précise par ailleurs que le gène en question (de mon chef) est inductible et n'est donc transcrit qu'en cas de stress (normalement). Les autres gènes sont des interleukines....
    Merci pour les conseils.

  14. #11
    Kemaro

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Excuse moi, mais j'ai une question à propos de ta gamme :
    Tu l'obtiens à partir de dilutions d'un échantillon? Ou à partir de la dilution d'un vecteur de concentration (et donc nombre de copies) connue, avec ton amplicon cloné dans la K7 de clonage??

  15. #12
    jmbowie

    Re : qPCR résultats hors gamme standard!!!

    Citation Envoyé par fenouillebzh Voir le message
    bonjour,
    comment expliquer des valeurs de Ct de PCR en temps réel supérieures à l'unité de copie? Je m'explique : dans une gamme standard une copie par µl sort à un Ct=30 mais mes échantillons sortent justement après. j'obient donc des resultats comme 0.01 copie par µl!!!!!!!
    quelqu'un a t il une solution?
    Des hybridation "aspécifiques" de tes amorces ou de ta sonde ? Cela dépend de ton échantillon aussi (pur ou échantillons biologique)
    Blast up your life!

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