Bonjour à tous, je suis nouvelle inscrite sur ce forum et j'espère qu'il appoprtera beaucoup de réponses à mes questions...
Je suis en thèse et je souhaiterai faire une manip de capture d'aspartate tritié sur coupes cérébrales (j'en fais déjà, mais sur des astrocytes in vitro).
J'ai beaucoup de mal à trouvé un protocole concernant cette manip, alors si quelqu'un a de l'expérience sur les slices, j'aimerai avoir vos conseils.
Merci d'avance!
Pendant ma thèse j'ai fais de la capture du glu-3H (en utilisant un système d'aspiration sous vide) sur des astro, d'autres gliales et des neurones en suspension. Lorsque j'ai essayé de passer sur des tranches c'était assez galère... (beaucoup de bruit de fond). Finalement je l'ai fais comme pour les cellules en changeant le filtre whatmann (j'utilisais les filtres GF/C pour les cellules et des filtres GF/B pour les slices).
Le proto est le suivant :
Les tranches était placées sur des inserts (ou une membrane de nylon) et j'incubais 15 min avec ma solution de glu-3H. Ensuite je prenais la membrane de nylon (avec la tranche dessus), je la plaçais sur le filtre whatmann dans une unité de filtration où on peut mettre 12 à 18 filtres (millipore) reliée à une pompe à vide. Pour arréter la capture, je faisais un double rinçage avec une solution sans sodium à 4°C (tu dois utiliser la même chose j'imagine pour mesurer la capture non spécifique). Et je mettais le tout (flitre whatmann, filtre nylon avec tranche) dans le scintillant puis au compteur.
