Salut!
Je voudrais me renseigner sur la technique du double hybride! Je connais le principe général et son utilité pour connaître le lien et les interactions entre une protéine connue et des protéines inconnues, mais ce que je voudrais en fait ce sont des protocoles et des informations précises et concrètes sur l'utilisation de cette technique!
Donc si vous avez des sites, ou des lectures, à me proposer, je suis preneur!
Merci d'avance à tout le monde!
A+
Tu pourras trouver des infos et un manuel d'utilisation relativement bien fait sur le site Clontech (BD Biosciences maintenant je crois). Le systeme que j'ai utilise il y a 4 ans, c'etait le MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 avec le guide de l'utilisateur ref PT3247-1. Je ne sais pas si d'autres systemes ont ete developpes, mais celui-ci avait la reputation de bien marcher...Envoyé par Vinc
Il y a un très bon article, en français, de Jacques Camonis, chercheur à l'Institut Curie, et expert dans le domaine. Il date un peu, mais il est très bien. Il est paru dans la revue "médecine/science" que tu peux toujours trouver à ta BU. Voici sa référence : Médecine/Science Juin-juillet 1994 - Anne Plessis, Jacques H. Camonis. Le système double-hybride, mode d'emploi. MÉDECINE/SCIENCES 10 (6-7) : I - IX.
Tu peux aussi voir le site de boites privées comme Hybrigenics ( y'en a une autre) qiu ont fait un crible systématique entre toutes les protéines existantes, à partir des cDNAs deduits des génomes de la levure, ou de la drosophile ( ça fait des matrices 4000X4000 pour la levure ou 13000X13000 chez la drosophile).
Ceci-dit, il y a plein de faux positifs, et actuellement des bioiformaticiens retraitent les données et, là, ça devient plus exploitable au niveau expérimental.
PS j'avais pas lu le msg précédent, mais Anne Plessis (Paris 7 , le crible étant à Curie) utilise le crible double-hybride Droso fait par la boîte privée.
pour info, je crois que Camonis est plus ou moins lié à Hybrigénics ...
Ok!!! Merci à tous pour vos réponses rapides!
Encore une petite question si vous avez utilisé cette technique : moi je suis passionné par tout ce qui est induction du signal, prot G, etc.... et donc cette technique m'est apparu comme la baguette magique!!! Parce que ça veut dire que, en théorie, cette technique est capable de mettre en évidence des liens fonctionnels entre différentes protéines et donc la découverte des voies de signalisation cellulaire parait donc beaucoup plus aisée et rapide! (ma question arrive...
Un de mes prof m'a dit que sur le papier une techniqe était toujours très belle mais que après dans la pratique ça ne se passe pas toujours à merveille! Je suis entièrement d'accord mais ici, il suffit de mettre comme gène celui de la luciférase (par exemple)et on voit tout de suite si il y a eu formation du facteur de transcription ou pas!!! Je pense que les problèmes ne viennent pas nescessairement de l'expression du gène mais plutôt de l'amont, mais bon là le fait de mettre un gène, dont l'expression est facile à repérer, doit quand même pas mal faciliter les choses, nan???
D'ou ma question: Cette technique est-elle réellement (un peu) "magique" ou est ce que je rêve complètement????
Merci d'avance pour vos réponses!
A+
Salut!
Oui cette technique est super... mais dotées d'un grand nombre de problèmes : les faux positifs!!!! Du style des interactions non spécifiques, qui seraient positives dans le résultat de ton double hybride etc.
En plus, Si dans ta voie de signalisation, les interactions sont faibles, tu ne verras pas forcément l'interaction par cette méthode ou du moins tu devras l'adapter.
Cette technique est donc super mais à compléter par des techniques de biochimie comme la co-immunoprécipitation pour montrer (ou contrôler) l'interaction.
D'où l'importance des contrôle et de la multiplicité des manips pour être sur d'un résultat!
Bonne journée
Lio
Salut,
en effet c'est loin d'etre la panacée...en plus ta luciferase tu ne pourras pas mesurer son activite in vivo chez la levure!
Bon courage
Yoyo
Chaque technique a ses limites et c'est souvent difficile de le voir sur le papier. La technique du double hybride a fait ses preuves et marche. Maintenant, comme le disait Lios, beaucoup de faux positifs et malgre les progres de la technique, les faux positifs sont inevitables. D'une part tu surexprimes des proteines fusions qui peuvent modifier les proprietes des proteines d'interet et tu forces des proteines a se rencontrer dans un meme compartiment cellulaire sans savoir (c'est aussi l'interet de la technique) si elles peuvent reellement se rencontrer dans une cellule. Ce n'est probablement pas pour rien qu'au palmares des faux positifs on trouve les proteines du proteasome...
Salut
Pourquoi???? Je ne vois pas...
C'est vrai que j'aurai pu preciser un peu, mais c'etait pour piquer ta curiosite
Tu ne peux pas mesurer l'activité luciferase in vivo chez la levure, car la luciferine (substrat de la luciferase) ne passe pas la paroi de la levure (qui est tres epaisse).
C'est pour cela que les test doubles hybride utilisent soit lacZ (qui permet de faire un test sur filtre pour verifier la couleur bleue en presence de X-gal) et/ou His (auxotrophie).
Malheureusement comme explique ci-dessus tu as 99% de faux positifs, par exemple toutes proteines interagissant aspecifiquement avec l'ADN (proteines basiques) vont activer ton systeme. Ensuite tu as beaucoup de tests de verif a faire, (chasse du plasmide, croisement pour verifier que c'est bien ton plasmide qui active les systemes rapporteurs). Enfin ce n'est qu'en identifiant plusieurs fois le meme genes dans des clones differents que tu peux imaginer une interaction avec ta proie.
Tu ne peux pas non plus eviter de verifier qu'il s'agit d'une interaction directe avec la proie et non pas d'une interaction indirecte qui serait médiée par une protéine endogene de la levure qui servirait de "pont". etc...
En bref le 2H est super quand tu souhaites etudier l'interaction entre deux proteines, ca l'est beaucoup moins bien quand tu veux faire un crible d'une banque.
Yoyo
Oups j'ai oublié deux choses.
Il faut que la banque que tu cribles soit representative, cela implique l'analyse de milliers de clones (selon la taille du genome), ensuite si tu cherches par expl a etudier les interactions avec des proteines membranaires la tu est mal, car dans le systeme 2H les proteines sont ciblées dans le noyau (comme l'indiquait igothigh), or une proteine membranaire surexprimée dans le noyau ca risque de s'agreger de de tuer ta cellule...
Donc tu ne peux pas toujours utiliser le 2H.
Yoyo
"(...)luciférase (par exemple)et on voit tout de suite si il y a eu formation du facteur de transcription ou pas!!!"
C'est du double où du simple hybride que tu veux faire?
Si du double... le FRET ou les puces proteines prennent leur envol
Si du simple les puces sont bien interressantes aussi...
cf.
Regulation of Gene Expression by a Metabolic Enzyme
David A. Hall,1 Heng Zhu,2* Xiaowei Zhu,3 Thomas Royce,1
Mark Gerstein,1 Michael Snyder1,2.
Science d’octobre dernier
C'est précisément le thème du labo de Camonis (non, chui pas payé pour lui faire de la pub !), décortiquer les réseaux de transduction du signal, héhé ... eh bien si t'es intéressé, tu peux toujours faire un tour sur la page de son labo et pourquoi pas faire un stage chez lui, on sait jamais ... en plus il est très sympa comme gars !Ok!!! Merci à tous pour vos réponses rapides!
Encore une petite question si vous avez utilisé cette technique : moi je suis passionné par tout ce qui est induction du signal, prot G, etc.... et donc cette technique m'est apparu comme la baguette magique!!! Parce que ça veut dire que, en théorie, cette technique est capable de mettre en évidence des liens fonctionnels entre différentes protéines et donc la découverte des voies de signalisation cellulaire parait donc beaucoup plus aisée et rapide! (ma question arrive...
http://www.curie.fr/recherche/themes..._equipe/86.htm
Re : Technique du Double Hybride
Yo mon frère du Y2H (Yeast two Hybrid) !
Des milliers de références existent, comme tu peux l'imaginer ! Mais doté de ma modeste expérience en la matière, je te préconise DEUX sites. Le premier concerne le site du labo de Gietz (une référence en la matière, comme Camonis, oui oui je sais)
http://www.umanitoba.ca/faculties/me...biochem/gietz/.
Ça parle des aspects de la transformations de levure, avec une sous-partie Y2H. Le site est très "protocole" (toutes les sauces sont décrites, avec les conseils du chef cuisinier, etc.)
Voici un autre lien vers une revue qui résume bien la technique Y2H (tu peux télécharger un PDF).
http://www.pubmedcentral.nih.gov/art...rtype=abstract
Le grand intérêt de cette revue, c'est qu'elle possède une vision très "pratique" mais aussi un aspect théorique, ce qui est parfait pour le débutant qui souhaite comprendre "le pourquoi et le comment". Par exemple, les auteurs discutent des différents paramètres à prendre en compte pour se lancer dans le criblage d'une banque. Bonne lecture….Pour faire court, il y a beaucoup de facteurs à envisager (et qui interagissent entre-eux, sans faire de jeux de mots), et il y en a tellement qu'on peut vraiment parler de "plusieurs" systèmes double hybride !
Comme le suggère le post de YoYo, le système Y2H semble simple et rapide sur le papier, bref limpide…mais c'est en fait une technique très "lourde" si tu te lances notamment dans le criblage de banque pour rechercher de nouveaux partenaires protéiques. "Lourde" dans le sens où elle demande beaucoup de vérifications, tu le constateras très vite !
Il faut que tu saches aussi que le Y2H n'est pas la panacéeEt oui
!
N'hésitez pas à me questionner pour d'autres infos ou pour se lancer dans des discussions fertiles !
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"La liberté commence où finit la connaissance" (Henri Laborit)
