a l'aide : double hybride en levure!!!!

[invitefeae5343]

j'ai besoin d'un peu d'aide a propos du double hybride.
J'ai fais queque experience preliminaire pour verifier que mes levures ont le bon phenotype, pour voir si mon gene rapporteur a une fuite transcriptionnelle, et pour voir l'efficacite de transformation et de cotransformation (sans ma banque pour l'instant). Je voudrais savoir :
-comment se calcul l'efficacite de transfo
-quelle est la meilleure astuce pour compter les colonies sachant que pour certaines boites (surement mal etalées) les colonies ne sont pas reparties de maniere homogene
-comment faire le calcul du nombre de colonie que j'ai a cribler pour couvrir l'ensemble de ma banque
merci de m'eclairer comme vous savez si bien le faire
katiaestelle
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[invitec9f0f895]

Salut

Alors l'efficacité de transfo est le nombre de colonie sur la boite obtenue avec 1 microgramme d'ADN. En général on se situe aux alentours de 10⁴.

Pour compter je sais pas, mais pour étaler de maniere homogene rien ne vaut les petites billes de verres! resultat garantie.

Tu prend la taille moyenne des inserts de ta banque, connaissant la taille du génome dont la banque est issu, tu sais combien d'inserts il te faut en théorie pour couvrir tout le génome (il faut aussi prendre en compte le nombre de vecteur "vide" (qui n'ont pas d'insert) dans ta banque s'il est important). Puis comme rien n'est jamais parfait tu multiplies ce chiffre de 3 à 10 selon la representatitivite que tu cherches. Tu vas finir par etre tres redondant (donc bcp de travail) mais tu seras sure d'avoir criblé tout le genome.

Yoyo

[inviteb753ced1]

j'ai besoin d'un peu d'aide a propos du double hybride.
-comment se calcul l'efficacite de transfo
-quelle est la meilleure astuce pour compter les colonies sachant que pour certaines boites (surement mal etalées) les colonies ne sont pas reparties de maniere homogene
-comment faire le calcul du nombre de colonie que j'ai a cribler pour couvrir l'ensemble de ma banque
merci de m'eclairer comme vous savez si bien le faire
katiaestelle

Astuce de comptage : tout d'abord bien étaler, c'est la condition première (comme le dit Yoyo, rien ne vaut les billes !). Après pour le comptage....j'ai fait ça "à l'oeil" ! Le tout est de travailler avec la bonne dilution (1/100, 1/1000...)

l'efficacite de co-transfo : étaler une partie aliquote de ta co-transfo sur un milieu de culture sélectionnant les deux plasmides (normalement c'est du -Trp/-Leu). Ta partie aliquote de ta co-transfo sera bien évidemment diluée (1/100, 1/1000) avant d'être étalée. Ensuite, tu prends en compte ces paramètres :

N:nombre de colonies visualisées
Va : Volume de la partie aliquoté étalé sur la boîte -Trp/-Leu (en µL)
Vtot : Volume total dans lequel tu as resuspendu tes levures après la co-transformation (en µL)
Q:quantité d'ADN utilisée lors de la cotransfo (en µg). Attention, il s'agit de la quantité de plasmide limitante (par exemple si tu as mis 5 µg de plasmide appât et 2 µg de plasmide de la banque, Q=2)
D = facteur de dilution utilisée pour l'étalement des colonies

Efficacité de cotransfo = (N x Vtot)/(Va x Q x D) = nombre de colonies par µg.

Exemple :J'ai transformé 15 µg de ma banque avec 5 µg de mon plasmide appât ; j'ai donc Q = 5. J'ai resuspendu ma co-transfo dans Vtot = 10 mL. J'ai pris 1 µL de la co-transfo, que j'ai mis dans 99 µL de milieu adéquat; ça me fait donc une dilution au 1/100 que j'étale sur ma boîte de Petri (en schématisant rapidement) : Va = 100 µL et D = 0,01. Au final, je compte N=100 colonies

Efficacite de co-transfo = (100 x 10000)/(100 x 0,01 x 5) = 200 000 colonies/µg d'ADN

Pour le nombre total de colonies screenées, la formule c'est : (eff. co-transfo) x Q.
Avec l'exemple précédent, ça donne : 200 000 x 5 = 1 million de colonies au total

Comme le dit Yoyo, pour être sûr de couvrir toute ta banque, il faut que ton nombre de clones screenées soit 3 à 10 fois supérieur à celui de la complexité de ta banque.

En espérant ne pas avoir fait d'erreurs...

a+