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isolation d'hepatocytes par perfusion a la collagenase(help:-( )



  1. #1
    manon87

    Smile isolation d'hepatocytes par perfusion a la collagenase(help:-( )

    bonjoure a tous, dans le but de faire une culture primaire d'hepatocyte, on procede dabord a l'isolation d'hepatocytes apartir du foie entier par la technique de perfusion a la collagenase(dissociation a la collagenase).pourriez vous m'eclairer sur cette technique.quel est le protocol a suivre?quel est le role de la collagenase?a quelle proportion est-elle ajoutee?
    merci d'avance .

    -----


  2. #2
    BioCell

    Re : isolation d'hepatocytes par perfusion a la collagenase(help:-( )

    Salut,

    j'utilise ce protocole pour l'isolement de cellules dendritiques à partir de la rate, ca doit marcher à peu près pareil...

    Perfuser l'organe avec la collagénase D chaude qui va digérer les tissus et isoler ainsi les cellules. J'utilise 5 mL (à 2mg/ml) par rate de rat.
    Couper l'organe en petit morceaux au scalpel et incuber 20 min à 37°C. Plus les morceaux seront petits, plus la digestion sera efficace.
    Arreter la réaction en ajoutant du PBS-SVF 5%-EDTA 0,1M froid.
    Broyer dans une passoire à thé avec le piston d'une seringue pour récupérer les cellules. Récupérer le broyat dans du PBS-SVF 5%-EDTA 0,1M froid et laver.
    Ensuite je réalise une centri sur gradient de densité pour ne récupérer que les dendritiques, je ne sais pas si c'est utile dans ton cas.
    Bien laver en PBS, et voilà!

    J'espere que ca t'aidera.
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  3. #3
    manon87

    Re : isolation d'hepatocytes par perfusion a la collagenase(help:-( )

    Citation Envoyé par BioCell Voir le message
    Salut,

    j'utilise ce protocole pour l'isolement de cellules dendritiques à partir de la rate, ca doit marcher à peu près pareil...

    Perfuser l'organe avec la collagénase D chaude qui va digérer les tissus et isoler ainsi les cellules. J'utilise 5 mL (à 2mg/ml) par rate de rat.
    Couper l'organe en petit morceaux au scalpel et incuber 20 min à 37°C. Plus les morceaux seront petits, plus la digestion sera efficace.
    Arreter la réaction en ajoutant du PBS-SVF 5%-EDTA 0,1M froid.
    Broyer dans une passoire à thé avec le piston d'une seringue pour récupérer les cellules. Récupérer le broyat dans du PBS-SVF 5%-EDTA 0,1M froid et laver.
    Ensuite je réalise une centri sur gradient de densité pour ne récupérer que les dendritiques, je ne sais pas si c'est utile dans ton cas.
    Bien laver en PBS, et voilà!

    J'espere que ca t'aidera.
    merci pour ton aide

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