Répondre à la discussion
Affichage des résultats 1 à 25 sur 25

Contrôler la pureté des protéines



  1. #1
    orilye

    Question Contrôler la pureté des protéines

    Bonjour à tous!

    Je suis en train d'étudier un article dans lequel les auteurs étudient l'interaction entre deux protéines. Pour cela ils ont produits différentes protéines entières ou tronquées.

    Question posée : Quelles expériences pourriez-vous réaliser pour contrôler la pureté des protéines produites et vérifier la fonctionnalité des protéines produites ??

    Pour contrôler les protéines j'ai penser à la spectrométrie de masse mais y a-t-il d'autres moyens ?

    Et qu'entendent-ils par fonctionnalité ? Faut-il montrer que les protéines interagissent toujours ou vérifier que leur fonction dans l'organisme n'est pas altéré ??

    Merci d'avance!
    Orilye.

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    samanthaa

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Ben je sais que pour etudier l'interaction entre 2 proteines on utilise la methode du double hybride. Je saurais pas te l expliquer car je connais son fonctionnement que pour les facteurs de transcription... jsais pas si c est ton cas ici?
    Puis pour verifier la purete je ferais sur un gel d un cote une coloration au bleu de coomassie qui va colorer toute tes proteines et de l'autre un western blot avec des anticorps diriges contre la proteine que tu veux.. puis tu compare les 2 gels...

    Sinon si il s'agit d enzyme on fait des calculs d activites enzymatique et apres on va pouvoir determiner le facteur de purification,.. Donc ca depend de la proteine dont tu parles??

  4. #3
    orilye

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Merci beaucoup pour ta réponse Samanthaa !

    Dans mon cas ce n'est pas un facteur de transcription mais des protéines qui lorsqu'elle interagissent permettre la réorganisation des microtubules! Ce n'est donc pas une enzyme non plus...

    Comparer un gel au bleu de Coomacie avec un western me parait être une bonne idée mais est-on sur que dans l'extrait protéique il n'y aura que la protéine que l'on veut étudier ? Si on utilise un anticorps contre notre protéine d'intérêt on ne verra qu'elle mais cela ne veux pas dire qu'il n'y a pas d'autres protéines que l'on ne voit pas?

  5. #4
    mantOs

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Citation Envoyé par orilye Voir le message
    Comparer un gel au bleu de Coomacie avec un western me parait être une bonne idée mais est-on sur que dans l'extrait protéique il n'y aura que la protéine que l'on veut étudier ? Si on utilise un anticorps contre notre protéine d'intérêt on ne verra qu'elle mais cela ne veux pas dire qu'il n'y a pas d'autres protéines que l'on ne voit pas?
    Si ta purification est bonne dans ton gel au coomassie tu devrai voir dans le cas idéal qu'une bande migrant à la même hauteur que la bande que tu revele sur le WB .


    Si tu travailles à partir d'un extrait protéique brut, ton gel coomassie contiendra beaucoups de bande mais dans le cas d'une surexpression de ta protéine d interet, la bande proiminante devrait migrer comme celle de ton WB .


    PS : le double hybride marche pas seulement pour les facteurs de trancriptions

    M'enfin les techniques de mise en évidence de relations protéines protéines sont variées : Co immunoprécipitation, SPR, double hybride , colone chromato .
    Desole pour l'absence d'accentuation, je suis sur clavier QWERTY.

  6. #5
    Yoyo

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Salut
    Pour voir une proteine contaminante en bleu de coomassie il va falloir qu'elle soit abondante (le bleu de coomassie n'est pas tres sensible).
    Une psectro de masse ou une revelation a l'argent seront bcp plus sensibles. Tout depend de la puretée dont tu as besoin.

    Yoyo

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Vinc

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Salut
    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Salut
    Pour voir une proteine contaminante en bleu de coomassie il va falloir qu'elle soit abondante (le bleu de coomassie n'est pas tres sensible).
    Si c'est sur une purif oui mais pas sur des extraits. Une bande en western correspond à environ 30 ou 40 protéine différentes c'est pour ça qu'il est préférable de faire de la 2D avant de passer en spectro de masse par exemple.


    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Une psectro de masse ou une revelation a l'argent seront bcp plus sensibles. Tout depend de la puretée dont tu as besoin.
    L'argent n'est pas quantitatif, d'où l'utilisation du bleu colloïdal et pour la spectro de masse je ne comprends pas trop ta remarque : ce sont 2 méthodes qui sont complèmentaires et qui apportent des data différentes.

    V.
    Primum non nocere.

  9. Publicité
  10. #7
    orilye

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Merci beaucoup pour toute vos réponses!

    Pour mon cas je crois que je vais prendre la coloration au bleu de coomacie!

    Dis-moi Vinc ça veut dire quoi "faire de la 2D" ??

  11. #8
    Vinc

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Citation Envoyé par orilye Voir le message
    Dis-moi Vinc ça veut dire quoi "faire de la 2D" ??
    C'est une électrophorèse bi dimensionelle.
    Une première électrophorèse permet de séparer les protéines sur un gradient de pH, selon leur Phi : les protéines vont migrer jusqu'à ce qu'elles s'immobilisent au niveau du pH pour lequel leur charge est nulle (=pHi ou pH isoélectrique). Ensuite on fait une deuxième électrophorèse classique SDS PAGE qui va séparer le sprotéines selon leur masse moléculaire.
    Donc au final les protéines sont séparées sur 2 dimension et selon 2 critères:
    - leur pHi
    - leur masse moléculaire
    C'est très pratique pour isoler spécifiquement une protéine car sur une électrophorèse SDS PAGE classique, seule la masse moléculaire est discriminante donc lorsque tu fais une coloration de ta membrane en rouge ponceau, tu observes une multitude de bandes et chaque bande correspond à de nombreuses protéines différentes.


    V.
    Primum non nocere.

  12. #9
    Yoyo

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    Salut

    Si c'est sur une purif oui mais pas sur des extraits. Une bande en western correspond à environ 30 ou 40 protéine différentes c'est pour ça qu'il est préférable de faire de la 2D avant de passer en spectro de masse par exemple.
    Comment ca en western une bande correspond a 30 ou 40 proteines?
    SI c'est comme ca que tu fais tes westerns je comprends les bonobos


    L'argent n'est pas quantitatif, d'où l'utilisation du bleu colloïdal et pour la spectro de masse je ne comprends pas trop ta remarque : ce sont 2 méthodes qui sont complèmentaires et qui apportent des data différentes.

    V.
    Je n'ai pas dit que l'argent etait quantitatif, mais etait plus sensible que le bleu de coomassie. Finallement c'est ce qui nous interesse quand on cherche a vérifier la puretée d'une protéine.
    Enfin il ne me semble pas bien raisonable de faire de la 2D pour verifier la puretée d'un echantillon, d'autant que la 2D a des limitations importantes notamment quant a la nature des proteines visibles.
    Pour ma remarque en spectro de masse, je voulais simplement dire que si ta protéine est pure tu le verras tout de suite, s'il y a des peptides contaminants aussi.

    En fait la difficulté est que chaque technique a ses limites et ses avantages

    Yoyo

  13. #10
    Vinc

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Comment ca en western une bande correspond a 30 ou 40 proteines?
    SI c'est comme ca que tu fais tes westerns je comprends les bonobos
    Oui en rouge ponceau une bande correspond à environ 30 ou 40 protéines différentes. Et ne t'en fais pas pour mes westerns....


    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Je n'ai pas dit que l'argent etait quantitatif, mais etait plus sensible que le bleu de coomassie. Finallement c'est ce qui nous interesse quand on cherche a vérifier la puretée d'une protéine.
    Enfin il ne me semble pas bien raisonable de faire de la 2D pour verifier la puretée d'un echantillon, d'autant que la 2D a des limitations importantes notamment quant a la nature des proteines visibles.
    Je n'ai jamais dit qu'il fallait faire de la 2D : j'ai donné un exemple pour montrer l'intérêt de la 2D lorsque l'on veut faire de la mass spec.
    Et les gens qui font de la protéomique te diront qu'il est beaucoup plus souhaitable d'utiliser le bleu coloïdal que l'argent : la sensibilité me parait moins importante que la quantification de la bande lorsque tu veux t'assurer d'avoir assez de protéine pour faire quelque chose avec.


    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Pour ma remarque en spectro de masse, je voulais simplement dire que si ta protéine est pure tu le verras tout de suite, s'il y a des peptides contaminants aussi.
    Je ne comprends pas ton raisonement. Tu viens de dire que la 2D était une technique lourde mais ce n'est rien comparé à la mass spec et faire de la mass spec sans 2D c'est un petit peu comme espérer gagner au loto en cochant un seul numéro....

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    En fait la difficulté est que chaque technique a ses limites et ses avantages
    Tout à fait. Ma remarque ne s'appliquait pas spécialement à la discussion mais simplement à ton message.

    V.
    Primum non nocere.

  14. #11
    Abricote

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Pour étudier l'interaction entre tes 2 protéines, j'ai 3 tests qui me viennent à l'esprit:
    -le FRAP ou transfert de fluorescence
    - une IP (immunoprécipitation) anti prot A par ex, suivie d'un IB (immunoblot) anti prot B
    -le pontage covalent suivi de 2 blots: un anti-protéine A, un anti-protéine B

    Pour étudier la fonctionnalité de tes protéines, il faudrait qu'on en sache un peu plus sur elles... Si A se lie à B qui se lie à la tubuline par ex, on peut imaginer une IP anti B suivie d'IBs anti A et anti tubuline... Si tout est positif, on pourrait peut être en déduire que ces 3 prot intergissent bien ensemble et donc, qu'elles sont fonctionnelles... (encore une fois, faut qu'on en sache un peu plus pour réaliser les contrôles adéquats...).
    Je suis unique, comme tout le monde.

  15. #12
    Alegs

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    On peut aussi faire une chromatographie sur colonne non?
    Je l'ai étudié un peu pour les intéractions immunoglobuline/antigène, mais il parait que ça peut aussi s'utiliser pour des enzymes ou autres!!

  16. Publicité
  17. #13
    piwi

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Le plus simple pour prouver l'interaction entre deux protéines c'est encore de produire les protéines en réticulocytes et de faire un gel shift (EMSA) non?
    Sinon le bleu colloidal (différent du bleu de coomassie) est pas mal du tout et évite de se faire suer à utiliser des sels d'argent pour lesquels il faut utiliser de l'ammoniac (c'est pas très agréable) et qui tachent. En tout cas nous on l'a adopté.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  18. #14
    Alegs

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    produire les protéines en réticulocytes
    Comment feriez vous donc? En utilisant la moelle osseuse?!
    Les réticulocytes sont les érythrocytes (globules rouges) du jour?!

    Et mon idée de chromatographie sur colonne?

  19. #15
    Abricote

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Le plus simple pour prouver l'interaction entre deux protéines c'est encore de produire les protéines en réticulocytes et de faire un gel shift (EMSA) non?
    Sinon le bleu colloidal (différent du bleu de coomassie) est pas mal du tout et évite de se faire suer à utiliser des sels d'argent pour lesquels il faut utiliser de l'ammoniac (c'est pas très agréable) et qui tachent. En tout cas nous on l'a adopté.

    Cordialement,
    piwi

    Un gel shift? Je pensais que ça n'était utilisé que pour les interactions ADN-protéine, puisque c'est la sonde ADN marquée qu'on visaualise...
    De plus, pourquoi vouloir faire exprimer par d'autres cellules les protéines qui sont de tte façon exprimées dans le système d'orilye: il suffit de purifier celles ci puisque justement, on veut savoir si celles ci sont fonctionnelles. J'comprends pas trop là


    Alegs, la chromato d'affinité sur colonne est une bonne technique de purif
    Je suis unique, comme tout le monde.

  20. #16
    piwi

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    le gel shift je vois plutôt ça pour une interaction proteine proteine.
    Ensuite j'ai effectivement perdu le fil de la question primaire en lisant les messages.
    Cependant il est écrit que les auteurs ont produits les protéines. C'est bien que l'on ne parle pas de protéines endogènes. D'où l'intérêt de produire ça dans un lysat de réticulocytes et de faire un gel shift pour tester la capacité des prot à interagir (puisque c'est sur ce point que la demande insistait)

    Quant à tester la fonctionnalité difficile de répondre quand on ne connait justement pas la fonction.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  21. #17
    piwi

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Je viens de revoir que ce sont des protéines qui permettent la polymérisation des microtubules. En théorie il suffirait de mettre des tubulines alpha et beta et de jouer avec les concentration de tout ce beau monde pour voir si on arrive à les faire polymériser ou dépolymériser.

    Sinon, le double hybride n'a d'intérêt que si vous voulez identifier des partenaires . Ca n'est pas le cas ici, on a déjà le partenaire.
    La colonne d'affinité c'est bien mais une affinité avec quoi? Facile sur le papier mais c'est pas évident.

    Si j'utilise une production avec le lysat de réticulocyte je rejoins ce qui a déjà été dit en suggérant simplement un gel de protéines. On doit avoir une patate énorme au niveau de nos prot et pas grand chose sur le reste du gel.


    Remarquez que si j'ai un anticorps on peut penser à d'autres choses. Mais là je suis tributaire de la qualité des anticorps.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  22. #18
    Abricote

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Piwi je ne te suis absolument pas. Pourquoi vouloir changer de modèle? Orilye veut savoir si les protéines exprimées dans son système sont fonctionnelles, quel intéret de prendre des réticulocytes? C'est la fonctionnalité dans le modèle d'Orilye qu'est intéressant ici...

    Ensuite, pour le gel shift, j'aimerais savoir ce qui sera marqué... Les protéines exprimées ici sont à priori non marquées... on met un acide aminé marqué dans le milieu, c'est ça?
    (quoique pr marquer les acides aminés radioactivement, faudrait déjà être autorisé à manipuler la radioactivité dans le labo concerné...)

    Finalement, sur la colonne d'affinité, je mettrais des anticorps anti-protéine testée ou encore, la protA quand on veut purifier la B et vice versa... Bien entendu, la protéine fixée sur la colonne serait achetée et non celle dont on teste la fonctionnalité
    Dernière modification par Abricote ; 08/12/2007 à 11h25.
    Je suis unique, comme tout le monde.

  23. Publicité
  24. #19
    piwi

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Je me suis pris les pieds dans le tapis avec mon EMSA, c'est n'importe quoi. Désolé...

    Un rien plus compliqué que mon idée de départ:
    Puisque je produis moi même mes protéines je peux les associer à un polyhistidine (plasmide type pET) et faire une colonne avec du cobalt ou faire un système GST (là je ne connais le nom des plasmides). Je reprends la colonne d'affinité mais je m'affranchis des spécificités de la protéine. J'y mets mon extrait protéique après avoir vérifié que j'ai bien un enrichissement satisfaisant.
    On peut considérer que les protéines sur la colonne sont les bonnes. On ajoute l'autre solution de protéines. On élue, normalement on récupère ce que l'on voulait (ou pas si il n'y a plus d'interaction) et on peut aussi récupérer (par compétition) ce qu'il y avait sur la colonne pour vérifier que c'était bien les bonnes protéines.

    Voilou un stratégie simple sur le papier mais qui peut être chiante à la paillasse. (on arrive pas à produire la protéine, la protéine n'est pas soluble....)
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  25. #20
    Abricote

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Ah... là nous sommes d'accord!! D'autant plus que la même idée m'est venue en mangeant... par contre, celà suppose qu'il faut revoir la stratégie de clonage: "il aurait fallu y penser avant de se lancer..."
    Je suis unique, comme tout le monde.

  26. #21
    piwi

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Comme on ne connait pas exactement la stratégie qu'ils ont adoptés, on peut estimer au vu de leurs objectifs qu'ils se sont organisés en fonction. De plus à choisir entre refaire un plasmide et produire un anticorps je choisis sans hésiter le plasmide. Plus simple, plus rapide (même en comptant tous les ennuis possibles, parole d'expert ), moins cher.

    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  27. #22
    Alegs

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    L'idée des réticulocytes (je ne sais pas si elle est toujours au goût du jour) m'intéresserait, par simple curiosité!!

    Le but c'est de faire produire quelque chose par notre propre organisme, par le biais de ces réticulocytes? (n'allez pas trop dans les détails, je suis encore à cheval sur la vulgarisation et la théorie brute scientifique ^^)

    (le débat en lui même est très intéressant, ça me fait utiliser de la biologie cellulaire, de la génétique, et de l'intro patho sur les anémies (réticulocytes, érythrocites...) de surcroît)

  28. #23
    Yoyo

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    les systemes de reticulocytes proviennent du lapin!
    ce sont des systemes acellulaires, qui ne contiennent quasiment que des ribosomes (et de la globine). Cela permet de faire de la traduction in-vitro et donc de synthetiser une proteine en fournissant un ARNm (il existe des systemes traduction/transcription couplés).
    On ajoute de la methionine/cysteine radioactives poru marquer les proteines nouvellement synthétisées.

    YOyo

  29. #24
    Alegs

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Superbe merci Yoyo!!

    Cela me fait cependant soulever une nouvelle question!
    Pourquoi rajoute-t-on des produits radioactifs? (la question porte bien sur produit, c'est à dire ce qui est traduit)
    Ne vaut-il pas mieux mettre des réactifs radioactifs (des ARNm, pour voir ce qu'ils deviennent!)

    Je ne sais pas si je me suis bien fait comprendre...! (désolé de dévier un peu du sujet...!!)

  30. Publicité
  31. #25
    Yoyo

    Re : Contrôler la pureté des protéines

    Si tu mets des ARN radioactifs, tu vas voir leur stabilité c'est tout!
    ce n'est pas du tout ce que tu cherches a voir. Et tu es obligé de marquer les protéines neosynthétisées car il y a enormement de globine !

    yoyo

Sur le même thème :

Discussions similaires

  1. controler des lumières par ordinateur
    Par beber28 dans le forum Électronique
    Réponses: 6
    Dernier message: 17/11/2007, 17h11
  2. Contrôler des luxeons
    Par Toufinet dans le forum Électronique
    Réponses: 16
    Dernier message: 15/04/2007, 13h11
  3. Réponses: 12
    Dernier message: 23/08/2006, 16h53
  4. Réponses: 0
    Dernier message: 02/10/2005, 09h26
  5. controler des condensateurs
    Par didams dans le forum Électronique
    Réponses: 1
    Dernier message: 14/06/2004, 12h57