Disparition inexplicable

[invite689529bc]

Bonjour,

J'utilise une protéine transgénique qui est en fusion avec le marqueur GFP. Grâce à la fluorescence il m'est possible de suivre l'expression de ma protéine dans le sang des animaux. Mais voilà que la fluorescence a subitement disparue de tous les animaux, alors que la protéine transgénique continue de s'exprimer. On se tord l'esprit dans notre équipe pour expliquer le phénomène, mais voilà par vraiment de solution.
Le transgéne s'est visiblement intégré au génome puisque on le retrouve sur plusieurs mois, mais comment expliquer que le GFP disparaisse alors que la protéine reste présente.
Je ne trouve nul part mention d'une durée de vie limitée pour le GFP.
Auriez-vous des suggestions ?

Merci ++
belouga7
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[invitec9f0f895]

SAlut

une reaction immunitaire contre la GFP?

YOyo

[gorben]

Salut,

En western blot c'est toujours une proteine de fusion?
J'ai eu ca avec la GFP (chez des procaryotes, important de preciser). Je l'avais attache a une proteine, c'etait stable sauf dans certaines conditions ou la GFP etait clivee puis degradee. je ne sais pas pourquoi ni par quel mecanisme.

A+

[invite689529bc]

Bonsoir,

Le problème c'est que cette réaction est quasi impossible, la protéine est exclusivement nucléaire.
Par ailleurs, je me dit que si le GFP venait à être libéré, par exemple après une mort cellulaire, les anticorps générés ne pourraient attaquer les cellules encore vivantes, puisque ces dernières n'expriment aucun épitope GFP à leur surface.
Surtout, pourquoi le GFP disparaît après 6 à 12 mois suivant les animaux et les expériences ?
Le point c'est que la protéine en question s'exprime dans toutes les cellules hématopoïétiques, lymphoïdes et myéloïdes. Les marquages en cytométrie de flux retrouvent un GFP dans toutes les lignées et quand la disparition survient elle affecte également toutes les cellules et surtout toutes les souris.
Je suis incapable de répondre...
Merci pour votre aide

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite689529bc]

Rebonsoir,

C'est un peu délicat, car on ne dispose pas d'anticorps contre cette protéine dans la communauté. Aussi on utilise un anti-GFP. Le hic c'est qu'en western je vois ma protéine de fusion au poids attendu (poids de la protéine + poids du GFP), mais chez ces souris la fluorescence sanguine était encore présente, donc il n'y a pas de soucis pour elles. Cela devient plus problématique quand je fais des western sur les cellules issues d'animaux ayant perdu l'expression de la fluorescence sanguine. Les résultats sont alors difficilement interprétables je me retrouve avec plusieurs bandes en western. Comme si le GFP était dégradé de façon différentielle, l'anticorps ne reconnaissant qu'une plus petite partie...
J'ai pensé à une dégradation du GFP, mais comment expliquer qu'elle survienne à la même période dans plusieurs cohortes de souris et sur toutes les cellules, ça je ne sais pas.
J'ai essayé de parlé avec des personnes en thérapie génique, en viro suspectant un problème avec le vecteur viral, mais aucun idée précise ne s'est dégagée.
Merci encore pour toutes vos idées qui sont les bienvenues
Belouga7

[gorben]

Salut,

C'est exactement ce que j'obtiens quand ma proteine (juste la partie GFP, pas la proteine) est clivee puis degradee.
La GFP a un temps de maturation de 30 min (folding + maturation du fluorochrome) ce qui est plutot long. Dans certaines conditions c'est mauvais pour la cellule et elle s'occupe de retablir la chose.
Ma fusion est Ts et sensible aux chocs osmotique (la proteine est ok, mais la GFP est retiree). Pourquoi, je n'en sait rien, mais ce qui est sur c'est que c'etait une degradation.

Maintenant, desole je ne sais pas pourquoi il y probleme avec tes animaux, mais ca ressemble bien a ce que j'obtiens. Une condition a t'elle changee?? les animaux ont vieillis, ca ne peut pas etre ca?

A+

[invite689529bc]

Hello,

Nos problèmes seraient équivalents, pourtant nos modèles sont différents, si tu me dis travailler sur les procaryotes. Pour ce qui est des conditions, en fait j'injecte dans mes souris des virions qui contiennent le géne en question en fusion avec GFP. Ce qui peut changer d'une expérience à l'autre c'est le titre viral, mais l'âge ne devrait pas entrer en ligne de compte, les souris ont entre 3 et 4 mois quand elles reçoivent l'injection virale. Les premières manip je suis parvenue à retrouver la fluorescence 6 mois post-injection dans les souris primaires. Lorsque je transplantais la moelle de ces animaux dans des souris secondaires, le GFP a été détecté les 4 premiers mois et après plus rien. Les expériences suivantes la fluorescence sanguine a été perdue dans les primaires au 4ème mois.
Merci Gorben,
Belouga7

[invite7ebb6db4]

Par rapport à se qui a été dis j'ai une proposition, bien que j'en convienne totalement hypothetique. Avec le vieillissement on observe habituellement (mais pas tout le temps) l'acidification des cellules, cette acidification des cellules pourrait peut etre rendre compte de l'inactivation de la GFP qui serai alors clivé.
Tu pourrais donc voir si l'acidification de tes cellules qui expriment encore ta proteine de fusion a les memes consequences. Quand tu aurra trouvé vraiment à quoi c'est du, je serai curieux de le savoir.
Merci et bon courage.

[invite689529bc]

Merci pour toutes vos suggestions.
Le hic c'est que toutes les cellules sont affectées par cette disparition quel que soit l'âge de la souris. Les dernières manip le GFP n'a persisté que 4 mois alors qu'auparavant il était détectable sur plus de 12 mois. Donc les cellules les plus agées continuaient d'exprimer le marqueur quand les plus jeunes l'avait déjà perdu. Ce qui me rassure c'est que Gorben observe le même phénomène.
Mais je vais essayer du côté de l'acidité, question un peu triviale, mais comment peut-on vérifier l'acidité des cellules ?

Merci encore,
Belouga7

[invite7ebb6db4]

Le plus simple me semble t'il, c'est d'utilisé une sonde fluorescente à pH (de type BCECF).
Sinon il faut essayé de mesurer l'activité de l'echangeur Na+/H+, le principale regulateur du pH de la cellule (mais bon à mon avis beaucoup trop compliqué, long et surtout il faut utilisé la radioactivité).
Voila j'espere que sa t'aideras, mais n'oublis pas, quand tu trouves la solution de nous en faire profiter, sa parait tres interessant.

[invitec9f0f895]

salut

a mon avis le plus simple est d'imaginer que ton insert n'est pas intégré dans le génome. Il persiste donc un certain temps (variable), il s'exprime sans probleme, puis fini par etre diué lors des divisions.

A moins d'un probleme technique avec la GFP, ce qui semble exclu par tes resultats de western, je ne vois pas d'autres explications.

YOyo

[invite689529bc]

Salut,

Je ne sais pas si je peux vraiment parlé de perte de mon insert, car les cellules recouvrent une résistance normale à une drogue.
Pour faire simple, les cellules non corrigées sont sensibles aux agents pontants et les dommages induits ne sont pas réparables, les cellules se dirigent alors vers un processus apoptotique.
EN revanche, les cellules exprimant le transgène recouvrent une résistance comparable à celles des sauvages. Bizarrement, la perte de fluorescence ne s'accompagne pas d'une perte de résistance. Ce qui me fait dire que seul le GFP serait altéré. Mais il est en fusion avec le gène codant ma protéine.

Le problème du western, c'est que les cellules de souris qui n'expriment plus de fluorescence sanguine ne donnent pas une protéine au poids attendu. Il est plus bas et je me retrouve avec plusieurs bandes, comme si je disposais de plusieurs isoformes de la protéine transgénique mais avec un portion GFP de taille variable.
Est-il possible d'envisager un saut de mon transgène, lors de ce saut se produirait, le GFP pourrait ne pas suivre.
Bien qu'il soit difficilement explicable que toutes les cellules de la circulation sanguine soient chez toutes les souris affectées au même moment.
Une autre chose, mais là je ne suis pas virologiste serait d'évoquer une instabilité des structures transgéniques en générale ou celles issues de vecteurs de type lentiviral. Mais rien sur PubMed.

À part la fragilité du GFP, je vois rien d'autre.
Encore merci

[invitef047ccfa]

est ce que vous disposez d'autres marqueurs que le GFP ?

[invite689529bc]

Malheureusement non, on ne peut faire de sondage qu'avec un anti-GFP.
J'ai recherché les zones d'homologie entre ma protéine d'intérêt et ses protéines "soeurs" (appartenant à la même famille et au même complexe). Bien que je ne sois pas assurée de disposer d'un épiotpe identique, j'ai quand même envisagé d'utiliser un anticoprs qui reconnaitrait une zone homologue. Mais aucune homologie de séquence. Mais mon gros soucis reste d'expliquer la perte de GFP en dépit du maintien d'une protéine fonctionnelle.
Merci pour toutes vos idées, c'est très gentil.
Belouga7

[invite7ebb6db4]

Au vu des derniere information il me semble logique de pouvoir afirmer que la disparition de la gfp est du à une modification d'un parametre du milieu.
En effet vu la durée de vie d'un globule rouge (plutot longue), il est impossible qu'ils perdent tous une partit du transgene (la GFP) en meme temps.
Il serait donc interessant de voire si le transcrit (ARNm) est lui aussi tronqué, ou si c'est seulement la proteine.
Ensuite qu'elle condition du milieu peut amené à ca?
P.S: A tu fais une pcr pour voir si tu pouvais amplifier la GFP? (on ne sait jamais...)
Bonne chance.

[invite689529bc]

Bonjour,

En fait j'ai fait un PCR GFP mais sur des cellules fluorescentes, je l'ai pas refait sur les non fluo, mais j'avoue que ça permettrait de déterminer si la perte est pré ou post transcriptionnelle.
Pour les conditions du milieu, je ne penserais pas qu'elles soient en cause, tout se passe in vivo dans le modèle murin, sur des souris du même âge.
Je fais un PCR GFP aujourd'hui et je vous redonne des nouvelles.
Merci encore,
Belouga7