obtenir un cDNA à partir d'une protéine

[invitef366c84e]

Bonsoir à tous,

J'ai une petite question qui me perturbe et j'ai beau lire des publications d'articles ,je ne comprend pas bien le raisonnement:
voilà j'aimerai savoir comment fait-on pour isoler le cDNA à partir d'une protéine que l'on a isolé.

Je sais que pour obtenir le cDNA, on applique une reverse transcription de l'ARNm puis on amplifie ce cDNA pour ensuite le séquencer. Mais le problème que je n'arrive pas à resoudre et de retrouver l'ARNm correspondant à la protéine.

J'ai pensé d'effectuer un Northern Blot à partir des ARN recueillis sur des cellules possédant la protéine isolée à un instant t (transcriptome). On détermine ainsi la taille des différents ARNm et on devine lequel est notre ARNm car sa taille est environ 3 fois supérieur à celle de la protéine. Mais cette technique ne me semble pas très précise, auriez vous une technique s'il vous plait me permettant d'éclaircir mon trouble?
-----

[invitee863e61a]

Bonsoir à tous,

J'ai une petite question qui me perturbe et j'ai beau lire des publications d'articles ,je ne comprend pas bien le raisonnement:
voilà j'aimerai savoir comment fait-on pour isoler le cDNA à partir d'une protéine que l'on a isolé.

Je sais que pour obtenir le cDNA, on applique une reverse transcription de l'ARNm puis on amplifie ce cDNA pour ensuite le séquencer. Mais le problème que je n'arrive pas à resoudre et de retrouver l'ARNm correspondant à la protéine.

J'ai pensé d'effectuer un Northern Blot à partir des ARN recueillis sur des cellules possédant la protéine isolée à un instant t (transcriptome). On détermine ainsi la taille des différents ARNm et on devine lequel est notre ARNm car sa taille est environ 3 fois supérieur à celle de la protéine. Mais cette technique ne me semble pas très précise, auriez vous une technique s'il vous plait me permettant d'éclaircir mon trouble?

On peut faire la synthèse de la molécule d'ADNc en connaissant la séquence de la protéine...en utilisant le code génétique. Etant donné son caractère dégénéré, il restera une incertitude sur certaines bases.

[invitef366c84e]

oui mais comme plusieurs codons correspondent à un acide aminé, il sera impossible d'avoir la séquence d'ADNc d'origine non?

[invitec9f0f895]

Salut

Le mieux est de comparer ta protéine avec les bases de données pour trouver des protéines homologues.
Une fois que c'est fait tu reperes les zones fortement conservées (site actifs par expl).
A partir de la sequence, tu calcules des oligos dégénérés (c'est a dire avec des ambiguités). Mais qui vont amplifier la région conservée sur l'ARNm.

tu sequences le cDNA et tu as ton cDNA (au moins une partie et tu marches apres de part et d'autres.
Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]