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exprimer une protéine dans E.COLI



  1. #1
    mimita20

    exprimer une protéine dans E.COLI

    Bonjour !
    Comment peut-on exprimer une proéteine d'un géne humain dans E.coli ??? (j'ai trouvé dans des sites qu'il faut cnstruire un ADNc )et comment on peut l'avoir aprés ???(par criblage immunologique non ??????) c'est ce que j'ai pu trouver mais en gros j'ai pas compris exactement la démarche.
    MERCI DE M'ECLAIRCIR LE SUJET ....

    -----


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  3. #2
    azzurela

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Oui en gros c'est ça,

    Tu pars d'ADN complémentaire, (pour avoir de l'ADNc, tu prends l'ARNm ne contenant plus d'introns de ton EUC, et puis grâce à une transcriptase reverse, l'ARNm est recopié en ADNc, qui ensuite peut eventuellement devenir ADN db)
    Ensuite, tu l'insert dans un plasmide, possédant une origine de réplication E.Coli, avec un gène de sélection (ex.: Résistance à lampiciline)

    La bactérie va commencer à produire ta protéine

    Mais, tu va devoir modifier ton transcrit d'ADN c de départ pour par exemple utiliser les ARNt que la bactérie utilise le plus souvent, et aussi , tu peux, par PCR, ajouter une séquence à ton plasmide permettant de secréter la protéine dans l'espace périplasmique ou extracellulaire ..

    Je sais pas si j'ai été plus clair,mais en ce moment j'étudie le même cours que toi

  4. #3
    MaliciaR

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    En gros, c'est ça...
    Mais il y a des points très importants à prendre en compte, par exemple le fait qu'E.coli est un procaryote, ce qui n'est pas le cas de l'Humain, donc il vaut mieux être sûr que le procaryote pourra produire une protéine fonctionnelle... Parce que tu peux bien essayer de la produire, mais ensuite? Tu ne fais pas une production d'une protéine en grosses quantités juste pour la petite gym du matin, mais tu le fais en général pour l'étudier. Donc, est-ce que ce modèle d'étude est un modèle adéquat, cela reste à vérifier.

    Vous êtes en quelle année, mimita et azzurela?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  5. #4
    azzurela

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Je suis en 3e Bac Biotechnologie (et oui ...dernière année ...dernier blocus )

    Dailleurs, je rajouterai aussi que si ton but est la production de protéines, les procaryotes c'est pas tip top car ils ne vont pas faire les modifications pos traductionnelles nécessaires, donc tu peux essayer de produire la protéine dans une cellule de levure, mais les modif' post-trad n'y sont quand meme pas géniales.

    Au fait, saurais tu me dire ce qui doit se trouver impérativement dans un plasmide destiné aux cellules de mammifaires ?

  6. #5
    MaliciaR

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Citation Envoyé par azzurela Voir le message
    Dailleurs, je rajouterai aussi que si ton but est la production de protéines, les procaryotes c'est pas tip top car ils ne vont pas faire les modifications pos traductionnelles nécessaires, donc tu peux essayer de produire la protéine dans une cellule de levure, mais les modif' post-trad n'y sont quand meme pas géniales.
    C'est ce dont je parlais justement. Et puis faut penser aux corps d'inclusion...

    Au fait, saurais tu me dire ce qui doit se trouver impérativement dans un plasmide destiné aux cellules de mammifaires ?
    Tu poses la question à qui, en fait?

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Yoyo

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Citation Envoyé par azzurela Voir le message
    Au fait, saurais tu me dire ce qui doit se trouver impérativement dans un plasmide destiné aux cellules de mammifaires ?
    il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.

    Yoyo

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  10. #7
    azzurela

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    C'est ce dont je parlais justement. Et puis faut penser aux corps d'inclusion...
    A propos des corps d'inclusion, j'ai ecrit dans mon cours que pour les éviter il fallait diminuer le taux d'expression des protéines, et ensuite j'ai noté qu'il fallait augment la synthèse des protéines subissant un remodelage avec les protéines chaperons.

    Ces deux phrases me semblent contraires, est ce que je me suis plantée ???

  11. #8
    mimita20

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    OK, merci pour votre aide, et le truc de criblage immunologique, on procéde comment ???

  12. #9
    Yoyo

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Citation Envoyé par azzurela Voir le message
    A propos des corps d'inclusion, j'ai ecrit dans mon cours que pour les éviter il fallait diminuer le taux d'expression des protéines, et ensuite j'ai noté qu'il fallait augment la synthèse des protéines subissant un remodelage avec les protéines chaperons.

    Ces deux phrases me semblent contraires, est ce que je me suis plantée ???
    en effet il faut abaisser la temperature de croissance des bacteries pour diminuer le taux d'expression et donc le risque d'avoir des corps d'inclusion.

    Sinon si tu surexprimes les proteines chaperonnes alors tu aides les proteines a se conformer correctement.

    YOyo

  13. #10
    azzurela

    Re : exprimer une protéine dans E.COLI

    Mmmmmhh ... pas con du tout Yoyo

    Merci pour ton aide

    Par contre, je ne sais pas ce que c'est le criblage immunologique, désolée mimita

    Bonne soirée à vous tous

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