Variations sur un thème de synthétase...

[invite17a570c1]

Bonjour,

J'ai un léger souci avec mon cher TD diffusé par mon prof chéri Il a décidé qu'on le faisait avant le cours dessus, question de nous bouger un peu les neurones...

Mais bon. Voici la chose:
On a observé chez certaines bactéries comme E.coli 20 ARNt-synthétases, mais chez d'autres, comme S. pneumoniae il n'y en a que 19. Ainsi, S. pneumoniae n'a pas de glutaminyl-ARNt-synthétase (GlnRS), mais possède en revanche une glutamyl-amido-transférase (gat) qui convertit le ARNt^Gln qui a été chargé d'un acide glutamique (par la GluRS) en Gln-ARNt^Gln par un mécanisme de transamidation :
E.coli : ARNt^Gln + glutamine -> Gln-ARNt^Gln

S. pneumoniae : ARNt^Gln + ac. glutamique(+GluRS) -> Glu-ARNt ^Gln + gat -> Gln-ARNt^Gln

1) Dans le but d'étudier la répartition de ces 2 mécanismes, une étude est menée par a) analyse de séquence pour les bactéries dont le génome a été séquencé, et b) par PCR dans les autres cas.
Q.1. Quelle stratégie devez-vous employer pour choisir les amorces spécifiques des deux gènes (E. coli et S. pneumoniae)? (On s'intéresse aux gènes d'une sous-unité de la Glu-amidotransférase = gatB et de la GlnRS).

Je sais interpreter mon gel, mais cette question d'oligos m'échappe... J'ai pensé à des histoires d'anticodon -> codon -> séquence ADN, mais ça ne m'a pas l'air convaincant... Donc?
Merci.

(Pour les arbres, après ).

Cordialement,
-----

[invitee863e61a]

Bonjour,


< S. pneumoniae sans GlnRS mais (gat) qui convertit le ARNtGln chargé Glu en Gln par transamidation >

1) Dans le but d'étudier la répartition de ces 2 mécanismes, une étude est menée par a) analyse de séquence pour les bactéries dont le génome a été séquencé, et b) par PCR dans les autres cas.
Q.1. Quelle stratégie devez-vous employer pour choisir les amorces spécifiques des deux gènes (E. coli et S. pneumoniae)? (On s'intéresse aux gènes d'une sous-unité de la Glu-amidotransférase = gatB et de la GlnRS).

(Pour les arbres, après ).

Je pense que l'analyse des séquences de chaque gène au sein de l'ensemble des bactéries au génome séquencée permet de repérer les régions les plus conservées, ce qui permet de dessiner les oligos sur ces régions. Ainsi, il est possible de rechercher tel ou tel gène par PCR dans les organismes étudiés en étant relativement confiant lorsque l'on a un résultat positif en PCR (une bande à la bonne taille).

[invite17a570c1]

Donc, pour toi, on fait un alignement multiple, puis on fait une PCR avec des primers dégénérés?

[invitee863e61a]

Donc, pour toi, on fait un alignement multiple, puis on fait une PCR avec des primers dégénérés?

Pas forcément. Si tu trouves un motif spécifique très bien conservé, tu peux tenter de dessiner l'oligo sans le dégénérer. Mais ce serait peut-être plus prudent en effet.

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Alignement multiple n'est peut être pas le mieux. Il vaut mieux utiliser quelque chose tel que EMBOSS align (pairwise alignment)
Ca ne change pas grand chose par rapport à un programme type clustal mais l'algorithme est fait pour ça, donc l'alignement sera de meilleur qualité. Autant en profiter.


Cordialement,
piwi

[invite17a570c1]

Oki doki
Suite des évènements...
Sur le gel, on a vu que chez E. coli il y a une bande qui correspond à GlnRS et chez S. pneumoniae non, alors qu'elle a une bande qui est gatB (absente chez E. coli). Ô surprise...

2) Analyse phylogénétique des glutamyl-(GluRS ou E) et glutaminyl-ARNt-synthétases (GlnRS ou Q) de divers Eucaryotes (H. sapiens, C. elegans, L. luteus, G. muris, S. cerevisiae) et Bactéries (E. coli, V. cholerae, H. influenza, N. gonorrhea, P. aeruginosa, D. radiodurans) a été réalisée. C. elegans et D. radiodurans possèdent 2 copies de GluRS (E1 et E2).
On a en résultat un arbre pour GlnRS et un autre pour GluRS. Celui de GluRS est très semblable à celui obtenu avec les autres ARNt-synthétases des mêmes organismes. En revanche, l'arbre des GlnRS semble différent.
Ils ont donné les bootstraps, c'est gentil, ainsi qu'indiqué que la longueur des branches horizontales est proportionnelle à la divergence de séquence observée.

Et là, pour décrire les arbres... Pas de scanner à la maison

Donc, l'arbre GlnRS (en PJ).

Q.1. Quelle(s) hypothèse(s) feriez-vous pour expliquer l'aspect différent de l'arbre obtenu avec la GlnRS, notamment la moindre longueur de ses branches?

La seule chose que je connaisse sur la longueur des branches est que cela reflète les vitesses différentes auxquelles "les horloges moléculaires" ont bougé. Autrement dit, cela inclut le fait que l'on a affaire à l'arbre le plus parcimonieux mais on prend en compte le fait que les changements n'apparaissent pas à vitesse constante. Est-ce cela?

Merci, Piwi

[invitee863e61a]

Oki doki

coli: 1 bande GlnRS
S. pneumoniae non, mais 1 bande gatB

2) (GluRS ou E) et (GlnRS ou Q)

de divers Eucaryotes et Bactéries

C. elegans et D. radiodurans possèdent 2 copies de GluRS (E1 et E2).

On a en résultat un arbre pour GlnRS et un autre pour GluRS. Celui de GluRS est très semblable à celui obtenu avec les autres ARNt-synthétases des mêmes organismes. En revanche, l'arbre des GlnRS semble différent.
Ils ont donné les bootstraps, c'est gentil, ainsi qu'indiqué que la longueur des branches horizontales est proportionnelle à la divergence de séquence observée.

Et là, pour décrire les arbres... Pas de scanner à la maison

Donc, l'arbre GlnRS (en PJ).

Q.1. Quelle(s) hypothèse(s) feriez-vous pour expliquer l'aspect différent de l'arbre obtenu avec la GlnRS, notamment la moindre longueur de ses branches?

Le fait que l'arbre des GlnRS présente des branches plus petites indique qu'il y a une divergence moindre entre les différents représentants de cette protéine extraits de différents organismes:
- soit ils 'agit d'un gène qui évolue plus lentement que le gène de GluRS
- soit elle est apparue plus récemment, elle a eu "moins le temps pour diverger" que GluRS qui est une protéine à la fonction très semblable

[invite17a570c1]

Le fait que l'arbre des GlnRS présente des branches plus petites indique qu'il y a une divergence moindre entre les différents représentants de cette protéine extraits de différents organismes:
- soit ils 'agit d'un gène qui évolue plus lentement que le gène de GluRS
- soit elle est apparue plus récemment, elle a eu "moins le temps pour diverger" que GluRS qui est une protéine à la fonction très semblable

Donc, c'est bon quand je disais :

Autrement dit, cela inclut le fait que l'on a affaire à l'arbre le plus parcimonieux mais on prend en compte le fait que les changements n'apparaissent pas à vitesse constante.

C'est cela qui est à la base de ton raisonnement ici, je me trompe?

Merci en tout cas, c'est super sympa

[invitee863e61a]

Donc, c'est bon quand je disais :

C'est cela qui est à la base de ton raisonnement ici, je me trompe?

Merci en tout cas, c'est super sympa

Oui, c'est surtout l'idée que tos les gènes n'évoluent pas tous à la même vitesse ni à vitesse constante.

De rien, cela me fait du bien aussi!

[invite17a570c1]

D'accord, merci Vive la culture générale, parfois ça sert quand même...

Sinon, il y a une dernière question qui m'échappe un peu... (les autres ça va ). En fait, dans l'arbre GluRS il y a un truc bizarre : les deux paires E1 et E2 chez C. elegans et D. radiodurans. En fait, tu as E1 de C. elegans dans un groupe avec H. sapiens (branches courtes), alors que E2 de C. elegans et E1 de D. radiodurans sont dans un autre groupe mais avec des branches 3 fois plus longues... E2 de D. radiodurans est groupe extérieur de ce dernier, branche énooorme.
Si je demande trop, tu le dis. Je ne le prendrai pas mal

[invitee863e61a]

D'accord, merci Vive la culture générale, parfois ça sert quand même...


arbre GluRS il y a un truc bizarre : les deux paires E1 et E2 chez C. elegans et D. radiodurans:

- tu as E1 de C. elegans dans un groupe avec H. sapiens (branches courtes),
- E2 de C. elegans et E1 de D. radiodurans sont dans un autre groupe mais avec des branches 3 fois plus longues
- E2 de D. radiodurans est groupe extérieur de ce dernier, branche énooorme.
Si je demande trop, tu le dis. Je ne le prendrai pas mal

Donc en gros les GluRS de tous les organismes ne sont pas apparentées. Cela suggère que la protéine a été inventée par la nature plusieurs fois, mais à partir de protéines différentes. Il y aurait une sorte d'évolution convergente pour la fonction mais pas forcément pour la séquence; cela peut aussi expliquer pourquoi il y a deux copies de GluRS dans chacune de ces bactéries et que ces 2 copies ne soient pas fortement apparentées.

Il y a peut-être un arbre de GlnRS-GluRs qui laisse penser que le GluRS ait pu être inventée à partir du GlnRS ou l'inverse?

[invite17a570c1]

Donc en gros les GluRS de tous les organismes ne sont pas apparentées. Cela suggère que la protéine a été inventée par la nature plusieurs fois, mais à partir de protéines différentes. Il y aurait une sorte d'évolution convergente pour la fonction mais pas forcément pour la séquence; cela peut aussi expliquer pourquoi il y a deux copies de GluRS dans chacune de ces bactéries et que ces 2 copies ne soient pas fortement apparentées.

La protéine serait inventée plusieurs fois? Mais pourquoi? Je veux dire, s'il y a une évolution convergente ensuite pour la fonction, c'est que cette protéine est importante, donc sa perte aurait dû être contre-sélectionnée... Non?

Il y a peut-être un arbre de GlnRS-GluRs qui laisse penser que le GluRS ait pu être inventée à partir du GlnRS ou l'inverse?

Non. En revanche, il y a l'arbre de la question suivante qui permet peut-être d'expliquer la chose. En fait, on y voit qu'au sein des Eubactéries il y a (grossièrement) 3 groupes :
(1) groupe possédant seulement une amido-transférase S. pneumoniae, mais aussi D. radiodurans qui a également la Gln-ARNt-synthétase);
(2) un autre - seulement une Gln-ARNt-synthétase (E. coli, H. influenza);
(3)un troisième - possédant les deux enzymes (P. aeruginosa, N. gonorrhoeae).

[invite17a570c1]

Mais pourquoi, si D. radiodurans possède les deux enzymes, il aurait deux GluRS différentes...?
Sinon, le groupe où sont E. coli et H. influenza est concordant avec la proximité qu'ils ont sur l'arbre.
Idem pour P. aeruginosa et N. gonorrhoeae.

Mais alors D. radiodurans...

[invitee863e61a]

La protéine serait inventée plusieurs fois? Mais pourquoi? Je veux dire, s'il y a une évolution convergente ensuite pour la fonction, c'est que cette protéine est importante, donc sa perte aurait dû être contre-sélectionnée... Non?

La protéine a pu être inventée chez plusieurs organismes, c'est ce que j'entendais par plusieurs fois. Elle aurait pu être crée à un moment de l'Evolution ou il a paru judicieux d'augmenter le nombre d'AA entrant dans la synthèse d'AA (je m'avance un peu là )

[QUOTE=MaliciaR;1515431]
Non. En revanche, il y a l'arbre de la question suivante qui permet peut-être d'expliquer la chose. En fait, on y voit qu'au sein des Eubactéries il y a (grossièrement) 3 groupes :
(1) groupe possédant seulement une amido-transférase S. pneumoniae, mais aussi D. radiodurans qui a également la Gln-ARNt-synthétase);
(2) un autre - seulement une Gln-ARNt-synthétase (E. coli, H. influenza);
(3)un troisième - possédant les deux enzymes (P. aeruginosa, N. gonorrhoeae)

Je croyais que les E.Coli avaient une GluRS?

[invite17a570c1]

La protéine a pu être inventée chez plusieurs organismes, c'est ce que j'entendais par plusieurs fois. Elle aurait pu être crée à un moment de l'Evolution ou il a paru judicieux d'augmenter le nombre d'AA entrant dans la synthèse d'AA (je m'avance un peu là )

Ah ok... Je vois mieux

Je croyais que les E.Coli avaient une GluRS?

Non, c'est une Gln qu'elles ont
Pourquoi cette remarque? Je veux dire, c'est cohérent ce que tu as énoncé

[invitee863e61a]

Mais pourquoi, si D. radiodurans possède les deux enzymes, il aurait deux GluRS différentes...?
Sinon, le groupe où sont E. coli et H. influenza est concordant avec la proximité qu'ils ont sur l'arbre.
Idem pour P. aeruginosa et N. gonorrhoeae.

Mais alors D. radiodurans...

J'allais justement te proposer de corréler avec un arbre phylogénétique des bactéries.

Deino n'aurait peut-être pas encore perdu l'un des deux GluRS, ou peut-être que """"c'est lui qui a créé GlnRS"""" à partir d'une GluRS. La Deino aurait créé sa propore GluRS toute seule, ce qui expliquerait pourquoi sa branche (E1 ou E2 je sais plus) est bien éloignée de toutes les autres.

[invite17a570c1]

Why not, en effet? Mais pour s'avancer dans cette voie, je devrais disposer d'un arbre enraciné... Ce qui n'est pas le cas. Donc, on verra à la correction demain Merci en tout cas, très sympa de ta part.
Cordialement,

[invitee863e61a]

Why not, en effet? Mais pour s'avancer dans cette voie, je devrais disposer d'un arbre enraciné... Ce qui n'est pas le cas. Donc, on verra à la correction demain Merci en tout cas, très sympa de ta part.
Cordialement,

De rien, tiens nous au courant :=)

[invite0aa1883c]

Salut les jeunes
Pour le placement des 2 séquences de D. radiodurans il y a 2 hypothèses.
-Soit il a récupérer un second gene d'un eucaryotes par transferts horizontal (par ex. de C elegans d'où le placement phylogénétique du second genes).
-Soit le gène a été dupliqués chez D. radiodurans et le second paralogue a accumulé un max de mutation. Comme il a beaucoup évolué, dans ton arbre tu va avoir un phénomène d'attraction des longues branches. C'est un fort artefact dans les phylogénies qui font que des séquences qui évoluent vite, qui ont beaucoup divergé, se regroupent ensemble dans l'arbre, indépendament des "vrais" relation phylogénétiques. Celà expliquerait simplement pourquoi le second gene de radiodurans a des branches méga longue et se positionne avec C. elegans d'une façon purement artefactuelle.

L'invention indépendante de 2 tRNAsynthetase me semble tres peu probable, ca fait une sacrée convergence de séquences quand même, ces séquences sont clairement homologue et issue d'un ancetre commun.

A+
J

[invite17a570c1]

Salut les jeunes
Pour le placement des 2 séquences de D. radiodurans il y a 2 hypothèses.
-Soit il a récupérer un second gene d'un eucaryotes par transferts horizontal (par ex. de C elegans d'où le placement phylogénétique du second genes).
-Soit le gène a été dupliqués chez D. radiodurans et le second paralogue a accumulé un max de mutation. Comme il a beaucoup évolué, dans ton arbre tu va avoir un phénomène d'attraction des longues branches. C'est un fort artefact dans les phylogénies qui font que des séquences qui évoluent vite, qui ont beaucoup divergé, se regroupent ensemble dans l'arbre, indépendament des "vrais" relation phylogénétiques. Celà expliquerait simplement pourquoi le second gene de radiodurans a des branches méga longue et se positionne avec C. elegans d'une façon purement artefactuelle.

L'invention indépendante de 2 tRNAsynthetase me semble tres peu probable, ca fait une sacrée convergence de séquences quand même, ces séquences sont clairement homologue et issue d'un ancetre commun.

A+
J

Salut, Papy

je donne des nouvelles
En fait, on n'a pas fini le TD... C'est assez frustrant, il faut l'avouer. Mais question de réflexion, mon prof très chéri nous a mis justement sur la piste de gènes orthologues/paralogues pour le cas de D. radiodurans
Par ailleurs, John, j'ai un peu de mal avec l'idée de récupération du gène à partir de C. elegans... C'est juste peut-être parce que des idées pareilles sont nouvelles pour mon cerveau figée d'étudiant Mais peux-tu développer un peu?
Qu'est-ce que le phénomène d'attraction des longues branches? Le fait qu'elles vont se retrouver dans la même catégorie, d'accord, mais pourquoi? Je veux dire, est-ce un souci de calcul,...? Je n'ai toujours pas eu mon cours dessus et je suis très curieuse Est-ce que quelqu'un pourrait me conseiller un ou plusieurs papiers ou sites parlant de phylogénie (vous savez, les matrices, le principe de vraisemblance, ces choses-là) mais à un niveau relativement accessible?
En ce qui concerne l'invention indépendante des ARNt-synthétases... Vu que c'est un élément vital essentiel, tu considères qu'il a été inventé une bonne fois pour toutes chez l'ancêtre commun et puis, il y a eu des évènements de duplication?

Merci pour toutes les réponses, en tout cas

Cordialement,

[invite0aa1883c]

Salut

Par ailleurs, John, j'ai un peu de mal avec l'idée de récupération du gène à partir de C. elegans... C'est juste peut-être parce que des idées pareilles sont nouvelles pour mon cerveau figée d'étudiant Mais peux-tu développer un peu?

C'est simplement lié au fait que les procaryotes ont la capacité a acquérir des nouveaux gènes par transfert latéral en provenance d'autres espèces. Il se peut que D. radiodurans ait récupéré le gene codant pour une tRNA synthétase d'un eucaryote, par exemple de C. elegans. Ainsi dans la phylogénie, une des tRNA synthétase de D. radiodurans est proche de celle de C. elegans.
Mais l'autre hypothèse (duplication du gene chez radiodurans) est aussi possible...

Qu'est-ce que le phénomène d'attraction des longues branches? Le fait qu'elles vont se retrouver dans la même catégorie, d'accord, mais pourquoi? Je veux dire, est-ce un souci de calcul,...? Je n'ai toujours pas eu mon cours dessus et je suis très curieuse Est-ce que quelqu'un pourrait me conseiller un ou plusieurs papiers ou sites parlant de phylogénie (vous savez, les matrices, le principe de vraisemblance, ces choses-là) mais à un niveau relativement accessible?

Pour l'attraction des longues branches tu as l'explication de wiki qui est pas mal : http://fr.wikipedia.org/wiki/Attract...ngues_branches.

Pour les phylogénies tu peux allez voir le site evo du CNRS, y a une partie écrite par G. Lecointre sur ce thème :

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosev...ecointre4.html

Dis moi si tu as des doutes...

En ce qui concerne l'invention indépendante des ARNt-synthétases... Vu que c'est un élément vital essentiel, tu considères qu'il a été inventé une bonne fois pour toutes chez l'ancêtre commun et puis, il y a eu des évènements de duplication?

Oui, chaque tRNA synthétase a été inventée 1 fois chez l'ancetre commun, ensuite il y a pu avoir des duplications, des transferts de genes etc...

A+
Papy J

[invite17a570c1]

Salut,

Pour l'attraction des longues branches tu as l'explication de wiki qui est pas mal : http://fr.wikipedia.org/wiki/Attract...ngues_branches.

Pour les phylogénies tu peux allez voir le site evo du CNRS, y a une partie écrite par G. Lecointre sur ce thème :

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosev...ecointre4.html

Dis moi si tu as des doutes...

Je profite de ta gentillesse pour te poser quelques questions (à partir du site du CNRS):

Compte tenu de l'homoplasie présente dans tous les jeux de données biologiques, il n'est pas possible de construire un arbre dont chaque distance entre deux espèces, obtenue par addition des longueurs de branches joignant les deux espèces dans l'arbre, soit strictement égale à la distance figurant dans la matrice de départ.

Qu'est-ce que l'homoplasie? Si je me souviens bien de ce que j'ai lu il y a fort longtemps, ce sont des analogies, càd des caractères communs à plusieurs taxa, mais absents chez l'ancêtre commun. Est-ce bien cela?
Je n'arrive pas vraiment à voir le lien entre les longueurs différentes qu'il fait là


Ensuite, en parlant du Neighbour-Joining, il dit :

L'originalité de cette méthode de distances est qu'elle introduit un critère de minimisation de longueur totale de l'arbre.

Ce que je connais de la méthode NJ:
* elle corrige UPGMA pour autoriser un taux de mutation différent depuis l'ancêtre commun (sur les longueurs des branches);
* il y a une correction de la matrice des distances pour tenir compte qu'on n'est plus en horloge moléculaire.
Mais comment cela se traduit en "minimisation de longueur totale de l'arbre"?

Bon, pour les autres une autre fois
Je vais manger

Cordialement,

[invite17a570c1]

Bonjour,

Papy J, je vois qu'on vous occupe à la maison de retraite

Trêve de conneries.
Donc, on a fini ce TD, vraiment passionnant! Je voulais revenir sur le fait que C. elegans possède deux copies, E1 et E2, ainsi que D. radiodurans.
Ce que l'on a supposé au vu des arbres est que c'est C. elegans a acquis l'une des copies par transfert horizontal (comme il broute des bactos, pas très étonnant). En revanche, en ce qui concerne D. radiodurans, on a émis l'hypothèse qu'il y a eu duplication du gène codant E, donc deux copies (E1 et E2) chez Deino, mais on a supposé que Pseudomonas n'a gardé qu'une copie. Et par la suite, il y a eu une divergence des gènes E1 et E2 de D. radiodurans.
Mon prof chéri nous a pipé deux mots sur l'attraction des longues branches Mais pas beaucoup Bref, on est petits et puis, comme il dit, ça n'intéresse pas grand-monde, alors...
Sinon, on avait une question subsidiaire qui était absolument insoluble sans son aide. Il s'agit de PET112 chez S.cerevisiae. C'est un gène nucléaire; une mutation l'affectant confère à la cellule une déficience respiratoire due à un dysfonctionnement mitochondrial. Cette déficience peut être corrigée par l'expression, dans la levure mutante, d'un gène bactérien. Ce gène (lequel doit, pour être actif, être modifié par l'adjonction en N-ter d'une séquence d'adressage mitochondriale) se révèle être le gène de structure d'une amido-transférase. La question est : quelle(s) réflexion(s) vous suggère ce cas de complémentation interspécifique?
Et c'est très intéressant, parce que c'est à ce qu'il paraît un cas de néo-fonctionnalité. Càd que les aminoacyl-synthétases reconnaissent une structure 3D. Or, les introns mitochondriaux sont structurés, càd qu'ils ont des séquences telles qu'ils peuvent adopter des structures 3D. Donc, la protéine bactérienne introduite dans la levure reconnaît des ARN autres que les ARNt... C'est assez fascinant
J'aimerais bien lire un article sur le sujet... Mais je n'ai pas dû le chercher correctement parce que je ne trouve rien

A bientôt!
Cordialement,