co-culture et western blot

[invite7066ccaf]

bonjour, je suis confronté à un problème technique.

Je bosse sur des Lympho T stimulés en co-culture (contact direct entre les cellules obligatoire) par des cellules dendritiques (DC) chargées avec l'Ag.

Je souhaite révéler en western blot la voie de transduction activée chez mes lympho (phospho Erk, phospho Zap 70 ...) après ce contact.

le problème est comment séparer mes LyT de mes DC pour ne lyser que les LyT, le tout sans trop exciter mes LyT (voire pas du tout) et en le faisant le plus rapidement possible car je teste des cinétiques d'activation.

Les DC que j'utilise sont au stade immatures donc non-adhérentes. Par contre c'est l'amour fou entre LyT et DC car quand elles sont collées, elles font pas semblant.

J'ai bien une petite idée pour procéder mais je voulais avoir d'autres avis éclairés.

merci de m'aider
-----

[invite4ff72fd5]

Salut

As tu pensé à réaliser un FACS anti-CD4 ?

[invitea0443c8c]

C'est ce que j'allais dire mais le problème est que le temps que tu fasses un FACS tu vas perdre le signal. L'approche en western n'est pas triviale. Je ne pense pas qu'un tri cellulaire soit compatible avec une cinétique mais je peux me tromper!
Pourquoi ne pas regarder tout ça en IF avec des anti-phospho Erk et anti phospho Zap70??? En plus le fait d'avoir 2 types cellulaires te permet d'avoir un contrôle interne : tu auras un signal uniquement dans tes LT.

V.

[invite7066ccaf]

Effectivement le passage au FACS ne sera pas possible, je dois immédiatement passer à 4°C les cellules que je récupère pour bloquer les kinases et phosphatases, donc pas de tri possible sur colonne ou au cytomètre. Et je compte bien passer mes cellules au confocal donc là pas de problème. Mais j'ai commencé mes tests fonctionnels sans co-cultures (stimulation par un Ag soluble) par western et du coup faudrait que je continue en blot.
En tout cas merci de vous être penché sur la question. Si d'autres idées vous viennent n'hésitez pas...

[A voir en vidéo sur Futura]