Problème avec gel d'acrylamide avec urée
Bonjour,
J'ai quelques problèmes avec un manip de purification de protéines sur chromatogaphie d'affinité et j'aurais voulu avoir votre avis.
L'expérience que je fais est la fixation d'ARN sur des billes de streptavidin-agarose. J'incube les billes avec des extraits nucléaires, je lave et j'élue les protéines avec un mélange d'acide acétique glacial 66% et 33mM MgCl2. Je précipite ensuite les protéines dans l'acétone (5 volumes) en présence de glycogène. Après plusieurs lavage Acétone/H20 5/1, je reprend mes protéines dans de l'urée 9M + 1mM DTT + 0,025% Bleu de bromophénol.
En parralèle, je fais migrer des extraits nucléaires repris dans du tampon de dépot laemmli 2X. Le gel est un gel 10% Acryl/Bisacryl. Je l'ai coloré à l'argent avec le kit SilverQuest.
voilà la photo de mon gel : http://www.zimagez.com/zimage/fxargent.php
Donc, pour que vous compreniez :
- 1ère piste : marqueurs moléculaires
- 2ème et 3ème piste : Protéines reprises dans de l'urée avec chromatographie d'affinité.
- 4ème piste : Extrait nucléaire Hela repris dans du laemmli.
Comme vous le voyez, il y a un énorme problème de migration pour les pistes 2 et 3, alors qu'il n'y a aucun problème pour l'extrait nucléaire repris dans du laemmli... J'en déduit que le problème ne vient pas de la migration ni du gel.
Vous auriez une idée ? Je vais faire quelques tests en parralèle, mais j'avoue que je ne comprends plus rien, cette manip marche normalement, ça fait des années que d'autres font exactement les mêmes choses. ça pourrait venir d'un lot d'urée foireux ?
Merci beaucoup de votre aide!
FX
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