Gel Shift : problème avec la compétition

[invite709e142f]

Bonjour,

J'essaie de démontrer que ma protéine (régulateur cytoplamique de système à deux composants) se fixe sur sur une séquence spécifique d'ADN. La protéine a été purifiée par une queue histidine que je lui ai ajouté. Les sondes que j'utilise sont des PCR purifiées sur gel.

J'ai fait plusieurs gels et j'obseve un shift avec ma protéine, en fait j'ai testé 4 quantités différentes de prot et quand j'augmente la quantité j'obtient un retard plus important.
Jusque là ça va.

Par contre lorsque j'ai réalisé une compétition avec ma sonde froide, avec un excès deX10 j'ai tjs un shift (qui tend à migrer moins loin que le shift sans compétiteur) et avec un excès de X35, j'obtient un shift plus important que sans le compétiteur et qu'avec la quantité X10, avec une intensité de ma bande plus grande.
2ème problème: j'ai également fait une compétition avec un ADN non spécifique (ADN plasmidique quelconque) et j'obtient la même chose mais avec les deux quantité de compétiteur je retadre encore plus.

Je suis un peu perdue, c'est la première fois que je fais de l'EMSA et personne n'as de solution à me proposer dans mon entourage.
Qu'est-ce qui pourrait expliquer ce phénomène, qui est reproductible (4 fois).
Y-a-il une manip ou des conditions opératoires à changer?

Merci de votre aide.

(je ne sais pas si c'est lié mais ma protéine précipite au frigo entre 2 manip ! Je n'utilise que le surnageant mais bon)
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[gorben]

Salut !

Ca ressemble a une fixation non specifique de ta proteine sur l'ADN. As tu fais un temoin de binding de ta proteine sur une sequence d'ADN non specifique (different de la competition)?

Ca arrive souvent qd tes conditions ne sont pas optimales et/ou que l'affinite de ta proteine pour l'ADN est tres important. Tu peux essayer de mofier la composition du tampon de shift. Es tu sure que ta proteine se fixe sur cette sequence d'ADN? Comment l'as tu identifiee?

Le fait que ta proteine precipite au frigo, ce n'est pas bon du tout ! Ta concentration change, et l'activite egalement. Generalement on conserve les proteines a -80 deg.

A+

[invite709e142f]

D'autres études ont montré que ma prot liait une séquence d'ADN X et que cette fixation était spécifique. J'ai reproduit ses manip avec ma séquence d'ADN Y pour savoir si il y avait également fixation. J'ai obtenu un retard sur gel similaire mais pour des quantités un peu supérieures de protéine.
Je pensais donc être dans les bonnes conditions.
Je m'attendais à avoir une compétition qui me montre une spécificité ou une non spécificité. Mais le résultat n'est ni l'un ni l'autre.
En PJ, l'un de mes gels (pas très beau je te l'accorde)
piste1:sonde seule
pistes 2 et 3: 2 quantités différentes de protéine (d'autres gels montrent un beau retard)
pistes 4 et 5:quantité de protéine de la piste 3 et compétition avec l'ADN spécifique (X10 et X35/sonde chaude)
pistes 6 et 7 : idem 4 et 5 avec de l'ADN non spécifique

C'est ce résultat que je ne comprends pas.

Sinon, je n'ai pas essayé de binding avec un ADN non spécifique seul.

En fait:
- As-tu une idée à la vue de ce gel pour expliquer ce qui se passe?
- Quelles modifications de tampon puis-je faire sachant que je suis dans les mêmes conditions que celles utilisées par les auteurs ayant montré une spécificité avec la séquence d'ADN X.
-Mon idée de la semaine : une chose diffère avec les manip de compétiton des autres auteurs. La protéine fixe la séquence X qu'elle soit phosphorylée ou non. Mais ils ont fait leur compétiton avec la protéine phosphorylée. Je pense essayer ça. Pense-tu que ça pourrait être une bonne explication à mon problème?

En tout cas merci beaucoup de te pencher sur la question.

A+

[invitec9f0f895]

Salut

as tu essayé avec la sequence X pour voir si le meme probleme se reproduit?
Sinon si ta proteine precipite au frigo, peut etre qu'elle s'aggrege facilement et s'accroche aspecifiquement a ton ADN.

yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Salut,

Comme l'a dit Yoyo, une proteine qui precipite au frigo ce n'est pas bon

Tu devrais vraiment utiliser des temoins pour ta manip :
- ta sequence Y
- la sequence X (temoin positif)
- une sequence d'ADN autre si possible n'etant la cible d'aucune regulation (un bout d'orf par exemple temoin negatif)

Pour mieux comparer tes 3 sequences doivent en theorie faire la meme taille.

Sinon a la vue de ton gel je dirai que ta proteine se colle un peu partout.

A+