isolation d'un plasmide

[invite654345]

Bonjour

J'aurai voulu savoir quelles sont les étapes requises pour isoler un plasmide .
Je pense qu'on doit lyser la cellule puis séparer sur colonne par centrifugation le plasmide...
De plus, lorsqu'on veut transformer une bactérie, vaut il mieux donner un légr choc thermique et une source chimique pour faciliter l'incorporation du plasmide ??

Ensuite lorsqu'on transforme une bactérie pour la transgenèse, c'est une bactérie qui ne possède pas de plasmide. Comment s'assurer que ce soit le cas??

Merci beaucoup
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[piwi]

Bonjour,

Succintement voici les etapes d'une préparation de plasmide. On joue sur le fait que le plasmide soit une petite molécule d'ADN superenroulée.

On récupère la culture de bactérie que l'on va traiter avec un detergeant ionique, le SDS et une la base forte, la soude. Ceci va dégrader les membranes et dénaturer les macromolécules (protéines + acides nucléiques).
On tamponne la soude avec de l'acétate de potassium. Les macromolécules (ADN génomique + protéines) peuvent se renaturer. Leur grande taille fait que cette renaturation ne permet pas de retrouver leur conformation native et il se forme un précipité blanc floconneux. Tout agit avec tout. L'ADN plasmidique, plus petit et plus compact peut retrouver lui sa forme native et reste exclu du précipité. Dés lors, un étape de centrigugation permet de séparer le plasmide (et les petites protéines et des ARNs) restés en solution, du reste précipité au fond du tube.
Enfin, on peu extraire l'ADN pour plus de propreté par un simple "phénol/chloroforme".

Pour les transformations, les deux sont possibles et en pratique c'est selon les bactéries dont on dispose. Maintenant je crois que le plus courant est d'avoir des bactéries que l'on soumet à un choc thermique.

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation? Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage)

Cordialement,
piwi

[invite654345]

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S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation? Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage)"


Déjà un tout tout grand merci piwi

Le fait qu'un plasmide existerait déjà dnas la bactérie ne va t'il pas diminuer la probabilité que celle ci incorpore notre plasmide d'intérêt?
Dès lors combien de plasmides une bactérie peut elle contenir?

[inviteb3dff26d]

Bonjour,

Normalement non, pas de souci, ça dépend surtout de la bactérie et de la taille du plasmide (c'est comme pour tout, plus c'est gros, moins ça rentre! Désolé).

Une bactérie ne contient la plupart du temps, pas plus d'un ou deux plasmides. Il vaut mieux éviter d'en mettre trop quand meme, la machinerie cellulaire commencerai à se sentir dépassée et à l'étroit.

Tu peux aussi vérifier la présence du plasmide par insertion d'un gene de résistance à un antibiotique (plus rapide que de faire des digestions ou séquençage) quand c'est possible.

A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6802ac2b]

Bonjour,
Les bactéries compétentes utilisées pour la transformation et l'amplification ne possédent pas de plasmides... pour t'en rendre compte, fait, à partir d'une colonie, une culture de bactéries non transformées d'une part et transformées d'autre part.... fait ensuite une miniprep d'ADN plasmidique... tu verras que tu as du DNA dans le clone transformé et que tu n'en as pas chez le non transformé.... si ce n'est pas le cas, c'est que tu as transformé des bactéries qui ont déjà un plasmide... ce qui ne devrait pas être le cas dans la majorité des utilsations faites en biomol.

[invite654345]

Merci à tous pour ces infos complémentaires

[invited4c30826]

Bonjour,

Juste une petite correction : Vous parlez d'isolement et non d'isolation...(thermique, phonique...)

Bonne journée

JPS