Rendement d'une purification

[invite0e34040e]

Bonsoir,

J'ai fais une purification d'une enzyme (la PAL).
Mon problème c'est que le sérum de base semble avoir une activité enzymatique moins importante que la fraction obtenue après dessalage (86 UI/l contre 143 UI/l).
Le dosage de l'activité s'est fait par dosage de l'absorption du produit de réaction (PNP). J'ai mesuré la vitesse de réaction avec l'absorbance sur 3minutes, et quand je compare cette vitesse pour le sérum avec celle de la fraction dessalée, j'obtiens effectivement une vitesse supérieure (donc activité supérieure) pour la fraction dessalée (0.031min^-1 contre 0.052min^-1).

Après moultes recherches sur Internet, j'ai trouvé quelques hypothèses :
-je me suis planté dans ma mesure d'absorbance
-certaines protéines de faible poids moléculaire présentes dans le sérum inhibent la PAL
-ce résultat est normal car l'enzyme est concentrée
-j'ai 2 mains gauches

Bon j'irai voir mon prof demain de toute façon mais j'aimerai ne pas passer pour un con surtout si j'ai mal réalisé ma manip.

Si quelqu'un a une idée, je le remercie grandement.

morphe
-----

[invite6487dc7f]

C'est peut être normale, je vois pas du tout quel genre d'étape est le dessalage mais j'imagine que t'enlève des minéraux. Alors si certains ions sont inhibiteur de la PAL pk pas non?
Sinon les volumes varient beaucoup avant et après l'étape?

[invited2c6d8a8]

Bonsoir,

Je ne sais pas la solution à ton probléme mais une purification n'est pas forcement égale à une concentration. Est tu certains d'avoir concentré ton serum? Sinon non, alors c'est pas le probleme.
Maintenant a tu calculé l'activité de ton enzyme à l'aide d'un etalon ou à l'aide du coefficient d'extinction moleculaire? (peut être une erreur de calcul?)
A tu traité un echantillon de controle? Si oui, par les 2 etapes?

Personnellement je ne connais pas d'éléments miniraux inhibiteurs de la PAL. Par contre, le magnesium intervient dans beaucoup de réactions enzymatiques, intervient il dans celle ci? Si oui t'aurait du trouver l'inverse.

[invite0e34040e]

Pour le dessalage en fait il s'agit de séparer les protéines des sels.

Et pour les volumes ben le volume après dessalage est assez important car il y a de la phase mobile, j'ai injecté 0.1mL et récupéré 2.6mL

Je n'ai pas encore calculé la quantité de protéine présente, il me manque 4 valeurs d'absorbance que j'aurai demain.

jigsaw : mon hypothèse de la concentration n'est pas bon, mais je me suis rabattu dessus. J'ai pensé à l'erreur de calcul, mais la base de toutes les formules est la vitesse de réaction (delta)Absorbance/min qui parait anormal

Merci à vous, mais je crois que je suis bon pour recommencer (non définitivement le vendredi après-midi n'est pas propice aux manipulations correctes)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6487dc7f]

Attend, tu as injecté 0,1mL, tu en récupère 2,6 (donc Fd =26) et t'as l'activité qui augmente???
C'est quoi ce bordel?
tes mesures d'activités on été faites de manière identique j'imagine?

[invite0e34040e]

Attend, tu as injecté 0,1mL, tu en récupère 2,6 (donc Fd =26) et t'as l'activité qui augmente???
C'est quoi ce bordel?
tes mesures d'activités on été faites de manière identique j'imagine?

(pas pu revenir plus tôt)

Oui et oui

Histoire de m'enfoncer encore plus : après l'électrophorèse, il s'avère que je n'ai même pas d'enzyme

J'ai donc dosé l'activité catalytique de l'eau, donc un conseil : buvez de la bière !