RT-PCR à partir d'ARNtot possible ?

[invite73d9c659]

Bonjour à tous,

j'ai deux questions importantes pour commencer un projet de recherche sur de la matière végétale (le blé) .

1) Pensez-vous qu'il soit possible d'effectuer une RT-PCR à partir d'ARNtot et non d'ARNm ? c'est à dire en utilisant des amorces oligo-dT (et donc spécifiquement complémentaires de la queue poly-A). Si oui, est-ce conseiller ?

2) Des test préliminaires de purification d'ARNm (utilisation des billes magnétiques invitrogen) me donnent un profil moyen sur gel d'acrylamyde 1% (présence de bandes et non de smear!). De plus, l'ARNm semble très variable (et difficile à quantifier). Avez vous un protocole de purification d'ARNm à conseiller ? (je démarre l'extraction ARNtot au trizol reagent).

bien a vous
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[invite8c0cc995]

Bien sur qu'il est possible de faire une RT-PCR à partir d'ARN total, c'est comme ça que cela est fait dans la majorité des cas.
Pour la purif des ARNm il existe aussi des colonnes de purif.

[piwi]

Le cas le plus classique est de partir d'ARN totaux. Ce sont vos amorces qui définissent la spécificité, pas la pureté en ARNm.
Ca n'a d'intérêt que si les messagers que vous ciblez sont en très faible concentration devant les autres ARNs. A ce moment là, le fait de passer en ARN polyA (ARNm en fait) permet d'enrichir votre extrait devant les autres ARN. C'est tout.

Cordialement,
piwi

[invite73d9c659]

merci, à vous deux, pour vos réponses.

j'ai une autre question.

Est-il possible d'amplifier l'ADNc monocatenaire, sans passer par la synthèse d'un double brin ? Selon moi, cela semble un peu difficile mais la littérature n'est pas très claire sur ce point.

Avez vous un protocole RT-PCR à conseiller ? un kit recommandable ?

Plus précisément, je souhaite recombiner mon ARNtot en ADNc afin de visualiser mes fragments par la technique ALFP sur une ABI3100.

merci d'avance.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite988260c1]

Est-il possible d'amplifier l'ADNc monocatenaire, sans passer par la synthèse d'un double brin ? Selon moi, cela semble un peu difficile mais la littérature n'est pas très claire sur ce point.

J'en serai très très très étonnée !

Dans "mon" labo (où je ne suis qu'une stagiaire M2) on extrait les ARN sur colonne avec les kit quiagen : kit mini pour moins de 10 millions de cellules et kit micro en dessous de 500 000 cellules. Ca marche bien : je fais des PCR quantitatives à partir de l'ARN de 160 cellules de souris. Il parait que le kit ambion est très bien aussi.

Pour la RT on utilise des amorces random hexamère (car pour gène rapporteur on a le 18 S du ribosome donc pas de poly A au bout) et la superscript II (parait que la superscript III est plus processive)

Si tu veux tester la qualité de tes ARN il faut trouver un labo ou ils ont des machines Agilent : on dépose 9 échantillons sur une "puce" qui resseble à une microplaque et on lance la machine magique qui recrée un gel virtuel par ordinateur. On peut avoir des beaux résultats pour 500 cellules seulement.

J'ai l'impression de faire de la pub... désolée promis j'ai pas d'action dans toutes ces entreprises !

[gorben]

Est-il possible d'amplifier l'ADNc monocatenaire, sans passer par la synthèse d'un double brin ? Selon moi, cela semble un peu difficile mais la littérature n'est pas très claire sur ce point.

Salut,

Oui c'est possible, suffit de faire une extension d'amorce sur ton cDNA pour avoir le brin complementaire, ensuite tu purifies tout ca pour enlever tes oligos, puis tu fais une PCR avec un seul primer (sequence du cDNA) pour avoir tout plein de cDNA
Generalement je fais ca sur une centaine de cycle avec une denaturation tres courte pour pas trop abimer l'enzyme.

A+

[invite73d9c659]

Merci pour vos réponses !

En réalité, j'utilise le kit superscript de dynabeads. Mon gel de détection (agarose 1%) me révèle que j'ai encore de l'ARNtot (tjs présence des deux bandes) alors que je ne devrais avoir que de l'ADNc. Probablement que le RNASe H, digère le complexe ARN-ADNc mais pas l'ARNtot.

Comment puis-je m'y prendre afin de m'en débarrasser ?

RNAse A ? RNAse I ?


une idée ?

bien à vous

[piwi]

Un peu de soude peut être....
Sinon bêtement de la RNase A

[invite73d9c659]

merci !

j'ai de l' "RNase/DNase-free from bovine pancreas" de ROCHE (cat. No. 11 119 915 001) (500µg/1ml), dans mon frigo.

Pouvez-vous me faire part d'un protocole pour le dosage et le temps d'incubation de l'échantillon avec l'enzyme. Faut-il dégrader/inactiver l'RNase après dégradation ?

bien à vous

[gorben]

Salut,

Tu peux aussi bouillir 5 min... les ARN aiment pas ca, surtout si tu as des ions metalliques.
Sinon la RNAse A c'est bien. Perso j'aime pas trop utiliser ca, j'ai toujours peur de contaminer mon matos pour une future extraction ARN...

A+

[piwi]

Surtout la mettre en solution dans un coin où l'on ne manipule pas l'ARN et puis ensuite un chouillat dans ton tube et c'est la fête aux ARN. Rapide et efficace.
Pour l'inactiver bon courage, c'est increvable