Vecteurs intégratif+inductible

[inviteec077029]

Bonjour,

J'ai un collégue qui à rencontrés enormément de difficultées pour établir une lignée stable avec un cDNA d'intêret.

Le problème c'est que sa marche en transitoire, mais pas en stable aucune surexpression en stable!!.
On a pensé que la surexpression pouvait être trop importante pour la cellule donc sa favoriserais la sélection des cellules qui exprime peu ou pas du tout.

On s'intéresse aujourd'hui à un vecteur inductible-intégratif-GFP 3 en 1 on veut:
1) pas perdre du temps à faire du clonage pour faire du stable
2) directement voir les transfectants avec un gène rapporteur
3) induire l'expression de notre prot d'intêret

Nous disposons d'un L2 donc des manips avec des vecteurs lentiviraux est faisable che znous
On est à la recherche d'un tel vecteur qui pourrait marcher dans des fibroblastes. Quelqu'un à t-il rencontrés les même problèmes??? quels à été votre démarche?
Avez-vous des conseils concernant les vecteurs?

Merci vraiment pour votre aide,,

cordialement,
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[inviteec077029]

quelqu'un à t-il des idées SVP??

[invitec9f0f895]

salut

souvent l'absence d'expression en stable viens du fait qu'il y a une inactivation du transgene car il est trop exprimé.

Sinon pour les vecteurs je peux te conseiller ceux vendus par clontech qui ont un promoteur inductible (tet- doxicycline) certains ont meme la GFp, la RFP etc...

YOyo

[inviteec077029]

Oui je suis entrain de voir sa . Le pbi-EGFP m'a l'air d'être intéressant. Un vecteur retroviral serait le mieux, mais le plus souvent ils sont associés avec un un promoteur de type CMV trop fort, pour le moment j'ai pas trouvé de vecteur rétroviral inductible d'ailleurs je me demande même si sa existe

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8c0cc995]

ce qui m'étonne un peu, c'est que souvent en transitoire, il y a plusieurs copie du vecteur par cellule, donc l'expression est plus forte qu'en stable. Dans mon cas, j'observais souvent une réduction de l'expression apres etre passé en stable.
Avez vous linéarisé le vecteur avant transfection ? Cela favorise l'intégration.
votre vecteur contient il le gène de resistance, ou le gène de resistance est il sur un vecteur auxilliaire co transféctés avec le vecteur GFP?
Ce que je ne comprends pas non plus, c'est que si c'est un vecteur inductible, normalement, il ne devrait pas y avoir d'expression en absence d'induction, et donc aucune raison qu'il y ait une sélection négative des transformants exprimant trop fortement, car la sélection se fait en absence d'induction. Ce raisonnement n'est pas valable si la GFP n'est pas en fusion avec votre protéine, et que la GFP vous sert de controle de transfection. Dans ce cas ce serait une toxicité due à la GFP, ce qui est connue, mais pourquoi n'est elle pas présente en transitoire ? Dans ce cas, qu'en est il de l'expression de la GFP dans vos stables ?

[inviteec077029]

Enfête justement pour le moment je n'aie pas téstés ni la GFP ni le système inductible. Ce qui ne marche pas pour moi c'est un vecteur avec un promoteur non inductible et sans tag il contient un gène de resistance néo