Salut à tous!
voila je voulais si la phosphorylation sur un résidu tyrosine pouvait cibler cette protéine vers une dégradation via le protéasome. Je n'ai trouvé que des complexes ubiquitine ligase qui se fixe à des sérines/thréonines phosphorylés mais jamais de tyrosines ...?!
Bonjour,
Qu'est-ce qui motive ta question? Je veux dire, est-ce qu'il y a des faits penchant dans la direction de ta question?
Cordialement,
Pour l'instant c'est très préliminaire... En fait dans des analyses de co-transfection d'une protéine X et d'une tyrosine kinase Y, j'ai trouvé une diminution énorme de la qté de X qd cotransfecté avec Y !!! et in vitro je sais que Y phosphoryle X sur tyrosine !
Salut
Je n'ai pas d'apriori, pourquoi pas!
Mais attention in vitro les kinases ont tendances a phosphoryler tout et n'importe quoi. tant que tu ne demontres pas la phosphorylation in vivo ca n'est pas recevable.
Yoyo
Envoyé par cheyenh
Et est ce que X s'accumule sous MG132? Est ce que l'ubiquitination de X est publiée? Est ce qu'il y a d'autres sites de phosphorylations de X mise à part cette tyrosine?
V.
Et est ce que ce n'est pas tout simplement un effet de compétition d'expression (ou de transfection) entre les deux plasmides??? Moi je commencerai par regarder ça avant de me lancer dans des explications physiologiques complexes
V.
C'est une tres bonne suggestion je trouve!Et est ce que ce n'est pas tout simplement un effet de compétition d'expression (ou de transfection) entre les deux plasmides??? Moi je commencerai par regarder ça avant de me lancer dans des explications physiologiques complexes
V.
YOyo
Excusez-moi de la naïveté de ma question, et de mon intrusion, mais une kinase n'est elle pas censée simplement remplacer 1 groupement OH par 1 phosphate tiré d'un ATP, ce qui explique "qu'elle phosphoryle tout ce qu'elle voit in vitro"?
Oui et non, oui a ce que tu dis, mais habituellement les kinases ne phosphorylent que des residus presents dans des motifs de reconnaissance bien defini.Excusez-moi de la naïveté de ma question, et de mon intrusion, mais une kinase n'est elle pas censée simplement remplacer 1 groupement OH par 1 phosphate tiré d'un ATP, ce qui explique "qu'elle phosphoryle tout ce qu'elle voit in vitro"?
In vitro, il y a perte de cette specificité ce qui fait que les kinases in vitro ne sont pas spécifiques.
YOyo
Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (?!) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test ! sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.
Bonsoir!!
J'en aurais volontiers demandé plus sur ces motifs de reconnaissance, par simple curiosité!!
C'est vrai, j'ai "croisé" de nombreuses phosphorylations partout dans l'organisme, mais alors c'est idiot mais je ne me suis jamais demandé d'où venait la "spécificité" in vivo!!
Merci d'avance!!
Mais alors je ne comprends pas vraiment à quoi servent les tests in vitro si la kinase perd toute restriction de reconnaissance !!!!!!!!!!!
Effectivement, mais c'est qu'il doit y avoir quelque chose in vivo qui guide cette kinase sur son substrat, et qu'il faudrait rajouter in vitro...
Mais je ne sais pas trop ce que c'est!
Désolé de "squatter" ton sujet
non t'inquiètes toutes les questions sont bonnes à poser !
Les kinases restent tout de même relativement spécifiques in vitro mais, il est vrai, beaucoup moins qu'in vivo...
V.
Désolé de continuer sur le hors-sujet mais qu'appelez-vous phosphorylation in vivo? Quelles méthodes pour l'évaluer? Western sur la protéine cible avec un anticorps dirigé contre un phosphoépitope généré par la kinase? Surexpression de la kinase, incubation brève avec P32, immunoprécipitation de la cible, gel SDS-PAGE puis autoradiographie? Inversement avec surexpression de la cible,....? Pour moi, in vivo, il peut y avoir beaucoup de problème de faux positifs aussi (séquence consensus de phosphorylations commune à plusieurs kinases en particulier). Le mieux resterais une démonstration par siRNA, avec absence de la phosphorylation dans ce cas...mais c'est très vache les phosphorylations...Donc in vitro + in vivo indispensable pour cette démonstration.
Gr€g
Tu prends le problème à l'envert. Phosphorylation in vivo signifie simplement que la phosphorylation a lieu dans un système non artificiel à 100%, à l'inverse des test in vitro. Après peu importe comment tu visualises cette phosphorylation (avec Ac spé, P32, etc....) : ça fait partie de la technique pas du système.
N'importe quelle manipe présente des avantages et des incovénients dont font partis les faux positifs et les faux négatifs. Il n'y a pas plus de faux positifs in vivo qu'in vitro. Un seule kinase peut phosphoryler plusieurs cibles différentes mais je n'appelle pas ça un faux positif : c'est physiologique, pas lié à la manipe.
La démonstration qu'une protéine est phosphorylée, doit s'appuyer sur un ensemble de manipes qui vont dans le même sens. Ces manipes doivent être réalisées dans des systèmes différents avec des techniques et des tactiques d'approches différentes de sorte qu'en regroupant l'ensemble des résultats on puisse affirmer que la protéine en question est phosphorylée, mais ceci est valable pour n'importe quelle question scientifique. Si tu veux montrer l'intéraction de 2 protéines tu peux faire du Y2H mais les reviewers vont te demander une co-IP pour confirmer, et du siRNA comme tu l'as évoqué : c'est le même principe.
V.
